酿酒微生物的研究进展

自然界任何环境条件下的微生物都不是一个单一的、彼此独立的群体，微生物和微生物之间的相互影响、依赖、互生、共生，同时微生物和环境间的特定关系，使微生物表现出与之相适应的形态和功能。中国白酒得天独厚的生态环境、传统的制曲工艺、特殊的发酵容器构成了纷繁复杂的微生物群。数十年来，众多的科研单位与科技工作者，对中国白酒的酿造微生物进行分离、鉴定，其种类主要包括四大类。原核生物中的细菌、放线菌，真核生物中的酵母、霉菌。下面主要以浓香型酿酒微生物的研究进展来进行阐述。

中国浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，发酵过程是栖息在窖池糟醅、窖泥中的庞大微生物区系在糟醅固、液、气三相界面的复杂的物质能量代谢过程。发酵过程中产生的黄水充当着窖泥与糟醅物质交换的载体，封窖发酵形成的窖内压力和含氧量变化使酒糟中的养分和来自曲药、环境的微生物及其代谢产物不断通过黄水进入泥中，而窖泥中的特种微生物种群及其代谢产物又不断地进入糟醅中，在实现窖泥自身新陈代谢的同时，也完成窖泥与糟醅的物质能量交换。窖泥微生物经过长期的驯化和变异发展，微生物种类不断丰富，慢慢形成了以己酸菌、丁酸菌为主的窖泥微生态菌群体系，其生命代谢所产生的复合窖香香气构成了浓香型白酒窖香浓郁的基础。窖池在连续生产过程中，每一个批次，窖池中就产生一次曲药微生物、环境微生物与窖泥微生物的相互迁徙以及微生物菌群在糟醅中的演化交替并趋于稳定。因而，每一次固态发酵过程，就是窖池微生态环境中微生物区系的一次动态平衡过程。而每一次平衡体系的形成，制约了窖池内物质代谢和能量代谢的走向，决定了白酒不同的风味特征。正因为中国浓香型白酒风格形成的独特性，中外科研人员对中国浓香型白酒窖池微生态系统及其构成做了大量的研究工作，并取得了一些可喜的成果。其中具有代表性的研究如下：

我国利用微生物进行谷物酿酒的历史至少可追溯到4000多年前的龙山文化时期，古人对曲药中微生物存在的认识也早于西方1500多年，但却一直停留在感性及外在描述上。随着17世纪显微镜的出现，19世纪中叶对发酵现象的本质性认识，外国人开始把目光转向了中国的酿酒曲药。据张文学查证，1892年，法国人A．Calmette研究了中国的小曲，从中分离出糖化力极强的鲁氏毛霉（Mucor rouxianus），建立起了利用淀粉发酵生产酒精的“阿米露法”（Amylo Process）。20世纪初以来，日本人齐藤、山崎等开始了对中国酿酒微生物的研究，20世纪90年代初，花井、横山等对中国大曲微生物区系的形成与酶活力的关系进行了详尽的调研，对各种酒曲中微生物区系、酶活力、化学成分等有了清楚的认识。横山等通过异地制曲实验比较，基本上已能再现中国曲的制备及其功能特性，在对天津某酿酒厂大曲进行微生物分类鉴定后，提出了中国大曲霉菌的主要类别是Absidia而非Rhizopus的看法。

我国科研工作者一直没有停止过对大曲的认识和对大曲微生物区系的研究，特别是20世纪80年代后期以来，随着对传统固态发酵白酒再认识的需要，对大曲微生物的研究也逐渐进入高潮，提出了曲药微生物代谢指纹分析理论等……

廖建民等在前人霉菌及酵母研究的基础上，对大曲中的细菌菌系进行了研究，指出曲药中的细菌主要是数量和种类均较多的芽孢杆菌，而无芽孢杆菌和球菌的数量相对较少；无芽孢杆菌主要是醋酸杆菌和乳酸杆菌，而球菌种类比较单一，主要是乳球菌类。

施安辉等对徐坊大曲的微生物区系进行了系统的调查，初步弄清了微生物的构成情况，认为中温大曲和中高温大曲的微生物区系的构成存在明显差异。中高温大曲中芽孢杆菌的数量和种类都较中温大曲多，而且还含有蜡状芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌；中温大曲中的酵母主要是酵母属和汉逊酵母属的种类，而中高温大曲主要是耐高温的假丝酵母和白地霉占优势；中温大曲的霉菌主要是黑曲霉、毛霉、根霉和青霉，而中高温大曲则主要是米曲霉、红曲霉和土曲霉等。

余有贵对中、后期在楼上培养的邵阳大曲进行了研究，探讨了制曲过程中位于曲外层和曲心的细菌、霉菌、酵母3类主要微生物的消长情况，认为主要微生物总数在初期出现高峰，中期步入低谷，后期在曲心稍有回升；前期以细菌和酵母菌为优势类群，中期以霉菌占优势，后期以霉菌和细菌居多；无论哪个时期，曲外层的霉菌数和酵母菌数明显高于曲心；而细菌数偏高的原因是中后期在二楼培菌，曲表保温保湿不够，而曲心水分难以排出，有利于细菌的过度增殖，影响出酒率与酒质。

赖登□等对中国浓香型白酒（水井坊）大曲生物酶功能进行了研究，通过对酶活力、产酸力、产酯力、氨基酸含量等进行分析，论述了中国浓香型白酒大曲中淀粉酶、糖化酶、蛋白水解酶、酯化合成酶活力的高低与浓香型白酒质量及产量之间的关系，在理论和实践上为大曲生产工艺的改进及在代谢调控上为白酒质量的控制提供了一定的依据。

闻长生、李顺成等成功地从大曲中分离出了具有较强酯化能力的菌株，应用在黄浆水的酯化中，使黄浆水中的有机酸类得到了充分利用，产生的酯化液用于白酒生产，酯化效率高、风味突出，酒质明显提高，不仅减少了污染物的排除，而且使过去弃之不用的副产物变废为宝，实现了企业内部的资源再生利用。

胡永松、王忠彦等对几家名酒厂的制曲过程，采用微机控制架式发酵的方式，进行生态环境的模拟研究，并利用计算机辅助方法对微生物类群及生化性能进行了分析，通过上万个数据的收集整理和计算机处理，认为采用人工生态环境模拟，完全可以制备质量稳定、优质率高的大曲，且液化酶和糖化酶活力明显提高，在节约空间、减轻劳动强度上有明显优势，经过几家名酒厂的生产实际应用，人工模拟制曲技术体现了良好的经济和社会效益。

吴衍庸等研究表明，浓香型酒曲中的细菌总数高于酱香型酒曲。芽孢菌则是酱香型酒曲高于浓香型酒曲；产酸菌、分解菌是浓香型酒曲高于酱香型酒曲。产酸细菌上，表现出不同浓香型酒的酒曲均高于酱香型郎酒酒曲，醋酸细菌数出现在郎酒酒曲上又高于其他浓香型酒酒曲，酒曲中存在一定数量的梭状芽孢杆菌，检测均为产丁酸的细菌，未检测到己酸菌的存在，这也说明丁酸菌在自然界中普遍存在；而己酸菌只在特定环境中生存，己酸菌分离多来自老窖泥，培养优质窖泥应增殖己酸菌以控制丁酸菌，这有利于新窖酒质的提高。浓香型酒曲与酱香型酒曲其细菌区系结构不同，主要反映在制曲温度上，由于酱香型酒曲为高温制曲，生产的是高温曲，因此，在菌群构成上，则以高温嗜热菌为主；浓香型酒曲以中温培菌，菌群则以常温菌为主。两类酒曲其菌群代谢特征不同，对白酒风味的形成产生不同影响，表现出酱香型酒与浓香型酒的特有风格。剑南春酒曲与其他的浓香型酒曲有异，菌群分析结果介于浓、酱香酒曲之间，分析可能仍与制曲温度有关，受制曲工艺影响所致。反应在剑南春酒独特风格上，是否与酒曲有关有待研究。

黄丹等最近从沪型大曲中筛选得到1株高产酯化酶的黄曲霉菌株，并对该菌产酯化酶条件进行了研究，该菌种以黄豆粉为N源，淀粉为C源，pH6.0，于36℃，150r/min恒温振荡培养72h，酶活力可达9.16u/mL。

对百年老窖进行了较系统的研究，见第九章第一节，窖泥微生物的研究促成了人工窖泥的成功培养，打破了新窖不能出好酒的规律，对浓香型大曲酒的发展起到了重要推动作用。

2004年剑南春在其发酵窖池的老窖泥中分离到产己酸的菌株，经BioLog微生物鉴定系统鉴定为“Clostridium cocleatum”，即耳涡形梭菌。该菌种在生理生化特性上与克拉瓦菌有明显的不同，在分类学上也有较远的距离。对该菌的单菌种发酵实验并利用气相色谱仪对发酵产物进行分析，证实在改良的巴氏培养基或厌氧培养基中，在一定的培养条件下，耳涡形梭菌发酵生成正丁醇、丁酸与己酸。耳涡形梭菌是至今行业内首次确定己酸菌的科学名称，这是我国酿酒行业的重大发现。

2006年刘莉荫等从浓香型窖池中分离到的24株片球菌，鉴定属于7个种，并提出了2个新种。从白酒窖池中分离得到数量和种类如此多的片球菌是研究窖池窖泥微生物群落构成的首次报道。大量的片球菌存在于窖池中，其代谢产物在发酵过程中应该会起到重要作用。已报道的片球菌不仅可作为促酵物，而且有些种可以降低发酵产物中的含胺量，对风味的形成有较大影响。

由于中国传统固态发酵白酒生产的工艺特殊性，以及相关研究技术及手段受生产地域、发酵周期、产品风格等多方面因素的限制，加之糟醅微生物区系研究的鉴定工作量相当浩大，对其动态性探讨相对较少，针对不同的生产厂家做了一些探索性的工作。现归纳如下。

熊昌绪采用新疆“八一”酒厂的浓香型特种酒醅，对其22d发酵过程中的微生物消长状况做了初步探索，实验中微生物按细菌、酵母、霉菌进行了初步分类和数量统计。整个发酵过程中，细菌总数高于霉菌和酵母，其中细菌数量的变化相对较小，细菌多为革兰染色G^-杆菌；酵母繁殖较快，第3天就达到数量高峰；霉菌在入窖时数量最多，估计与大曲粉中存在大量霉菌有关。根据对霉菌的镜检及分析情况，显示酒醅中多为黑曲霉和黄曲霉，根霉和毛霉数量极少，青霉罕见，估计为污染。

罗志腾对西安大曲发酵酒醅在13d发酵过程中的微生物区系做了初步研究，初步弄清了细菌、霉菌和酵母之间的相互消长规律，同时对发酵过程中微生物的消长原因进行了初步探索。根据菌落统计分析结果，细菌总数占全部微生物数量的47.68％，酵母占48.37％，霉菌占3.93％。霉菌在入窖后前3d有少量存在，进入中期后低于10d不能被发现；酵母的数量优势在发酵前期，进入中期后急剧下降；细菌随发酵时间延长逐渐增加，后期数量达到最高峰。在窖池不同深度，微生物的分布存在差异，大体为浅层较多，深层较少。全部75份样品中得到192株菌，计24属微生物，分别是酵母4种，霉菌5种，细菌15种。细菌中的优势菌主要是芽孢杆菌2种，节杆菌1种，醋酸杆菌2种；酵母有汉逊酵母、假丝酵母、酿酒酵母和红酵母；霉菌有根霉、毛霉、青霉和曲霉。

施安辉以山东兰陵美酒厂及莘县酒厂的特曲窖为试验窖，对浓香型白酒50d发酵过程中酒醅微生物区系进行了动态跟踪，初步剖析了动态发酵过程中酒醅中微生物的构成其数量变化状态。根据分析结果，细菌总数以发酵第3天最高（8.0×10⁵个/g糟），以后逐渐下降，其中芽孢杆菌发酵第8天达到最高（1.9×10⁵），30d后几乎全是芽孢杆菌，以己酸菌、丁酸菌为主，其次是乳酸菌；酵母总数在发酵第3天最高（3.3×10⁷个/g糟），以后逐渐下降；霉菌总数在发酵8d内急剧下降。20d后回升到入窖水平，发酵50d下降到最低点。各类微生物常规分类的鉴定结果显示，细菌类分别是短杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属、丁酸杆菌属、芽孢杆菌属、芽孢梭菌属、微球菌属、甲烷杆菌属等，以芽孢杆菌属为主；酵母类分别是汉逊酵母属、酵母菌属、球拟酵母属、假丝酵母属、红酵母属、德巴利酵母属等，以汉逊酵母属、酵母菌属为主；霉菌类主要是曲霉，其次是根霉，毛霉一般3d后即消失，曲霉中大多是黄曲霉（部分米曲霉）。

2006年罗俊成等从泸州老窖国宝窖池酒醅中分离到69株芽孢杆菌，通过形态特征和生理特性检测等传统鉴定方法，将其归为5个类群。用聚合酶链反应（PCR）扩增出5个类群代表菌株的16S rDNA基因全序列，并对其进行测序。用blast软件在Genbank中进行所得序列的同源性检索，并构建系统发育树。从系统发育树可以看出，样品中芽孢杆菌以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amylolique faciens）为主，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）也占有相当的比例，还有一定数量的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）表明窖池酒醅中芽孢杆菌呈现多样性，且优势种群不明显。

2007年赵东等以五粮液技术中心试验窖池为研究对象，通过跟踪发酵过程取样，对酒醅中的微生物区系及其生态因子进行了研究，初步揭示了酒醅微生物区系与酒醅生态因子在演变过程中的相互关系，对浓香型白酒的发酵机理进行了初步阐述。研究发现在发酵初期，窖池内存在大量氧气，加之酒醅中有机酸和酒精含量都相对较低，好氧细菌、酵母菌、霉菌等需氧生长微生物都得到了迅速增殖。而杂醇油主要在这一时期产生。由于微生物生长过程中代谢产热，促进了窖内温度的迅速升高。随着发酵进程的向前推移，窖内氧气迅速耗尽，好氧细菌、霉菌迅速消亡。发酵2～15d为酒精主发酵期，酵母菌则在发酵2～5d边生长边发酵，而后，随着酒醅中酒精含量的逐渐提高，大量对环境耐受力差的酵母菌发生自融消亡。在酒精主发酵期内产生了大量热量，促进了酒醅温度的迅速升高。在发酵中后期，窖池酒醅处于厌氧环境，乳酸菌的代谢活动开始活跃，产生了大量的乳酸，促使窖内酒醅的酸度迅速升高。在此阶段，酒醅内酸与乙醇的含量都很高，酸醇酯化反应加速，生成了大量以乳酸乙酯为主的酯类物质。另外取样分析发现，中层边糟醅样中的己酸、丁酸以及与它们相对应的己酸乙酯、丁酸乙酯的含量均高于同期的中层中心样，证明己酸和丁酸以及相应的酯类物质的形成与来源于窖泥的功能性微生物息息相关。

提出了对乳酸菌作用的再认识：过去人们谈“增己降乳”，主要是因为发酵过程中乳酸菌过度产酸，己酸菌代谢产己酸活动受到抑制，造成酒体中乳酸和己酸以及它们相应的乙酯比例失调，进而失去浓香型白酒的典型风格。然而，乳酸菌在浓香型白酒生产中的重要作用不可忽视，在发酵中后期，糟醅中的乳酸菌占据了微生物的主体地位，通过代谢活动产生了大量的乳酸，有效地抑制了部分杂菌的代谢活动。乳酸菌代谢产生的乳酸以及由乳酸衍生而来的乳酸乙酯是酒醅中除乙醇外的最重要的微生物代谢产物。通过蒸馏，部分乳酸和乳酸乙酯进入酒体中，它们与其他成分按适当比例存在，能够增强酒体的浓厚感，是浓香型白酒风格形成的重要物质基础。因此，需要在生产中对乳酸菌进行有效的控制，控制其代谢所产生的酸酯在合理的范围内，对发酵产酒以及最终酒体风格的形成做出积极的贡献。

在中国传统白酒特定的酿酒微生物环境中，微生物群与其存在的微环境就构成了微生态系统，满足物质循环、能量流动和信息传递的“三流运转”规律。来源于窖泥、曲药以及生产现场的各种微生物，经过窖泥和糟醅之间不断的菌群迁徙演变和物质能量交换，最后在糟醅中达到一个平衡，形成特有的糟醅微生物区系而伴随平衡的形成，完成固态白酒发酵生产的基本过程。可以说，浓香型白酒窖池微生态是由从大曲、窖泥及园区生产现场微生物演化而来的糟醅微生物区系所构成，通过生产发酵产品体现窖池主要功能菌的存在状态，特别是曲药微生物和窖泥微生物，是糟醅微生物生态形成的基础，窖池中的所有微生物和其所处的特定的窖池环境构成了彼此相互作用、相互联系的统一体，即窖池微生态系统。

中国的酿酒文化源远流长，而酿酒与环境的相互关系，自古就被我国人民所重视并在生产实践中自觉和不自觉地运用着生态学的原理及方法。古人酿酒，自然环境的气候状况、土壤条件、水质优劣都是必须考虑的因素，而与之相适应的酿酒技术的不断改良和进步，造就了多种多样各具风格的酒类品牌，丰富了中国的酿酒文化。而符合自然地理规律构筑而成的中国传统固态发酵酿酒窖池，浓缩了自然环境的各种地域特征，成为酿酒生产的基本单元。窖池微生态系统，作为酿酒生产园区更大系统的有机组成部分，通过酿酒生产园区从属于所处的周边自然地理环境，依托周边大生态圈而存在。针对中国传统酿酒行业能耗高、生产率低、环境污染严重的生产实际出发，不少学者发起了发展我国生态酿酒产业的倡议，在20世纪90年代末，促成了我国第一个生态酿酒工业园区——沱牌酿酒生态园的诞生。

浓香型白酒窖池菌种资源丰富，窖池内存在的各种类型微生物可以充分得以利用，然而由于技术手段的落后，窖池内的多种微生物资源并未被充分认识和发挥作用，因而有必要集中人力和物力，合理组合各种常规菌种分离鉴定方法和多种分子生物学分类鉴定技术，加强窖池微生物区系研究的力度，弄清影响窖池微生物分布及演变的各种因素，通过分离培养、分析保藏这些微生物菌种及其基因，从而有效地保存和利用这些资源，并进一步把对有益微生物的利用从酿酒行业逐步发展到其他微生物工程领域。

浓香型白酒发酵过程中存在多种物质代谢反应，但目前大多是定性的描述，很多代谢反应途径实际上并不清楚，更谈不上定量分析。因而有必要充分利用现有的各种先进的分析测试技术及自动化监测手段，对窖池物质代谢过程进行分析测定及代谢监控，弄清窖池发酵过程中的各种物质变化与多种酶学反应的相关性，主要窖池功能菌与发酵过程的物质变化关系，特定生化代谢反应与曲酒风格和质量变化的相关性等，特别是关键物质成分，如人体功能性成分的来源、变化及走向以及对人体保健作用的分析等基础研究工作的顺利开展，可以为中国浓香型白酒的工艺改良和品质提高提供必要的理论依据和坚实的技术基础。

中国传统固态发酵浓香型白酒窖池实际上是依托一定的地理环境形成的特定微生态系统，满足物质循环、能量流动和信息传递“三流运转”的系统法则，因而在充分了解和弄清窖池发酵过程中各种微生物消长规律及物质变化规律的基础上，建立窖池微生态数据库，可指导生产和改善工艺；同时通过开发多菌种复合发酵剂。实现窖池微生态系统的再现和模拟，可进一步加深对窖池物质能量代谢规律的认识，打破地域和品牌的限制，促进高品质中国浓香型白酒在中国及全世界的普及和推广。而且，由于微生态系统分析方法的相通性，中国浓香型白酒窖池微生态研究的成果，对其他领域微生态系统的研究也具有积极的指导意义和有效的借鉴作用。以便通过对难以或不能培养的共生性微生物菌群的区系分析，进一步完善窖泥中微生物的种群构成和分布研究。

对其他香型酒的研究，各大名酒厂、科研院校等也一直在进行，新的研究成果有：

江南大学等对白酒窖池发酵的全程跟踪取样，借助于PCR-变性梯度凝胶电泳（DGGE）和16S rRNA基因文库两种方法，对比研究了江苏地区浓香型和芝麻香型白酒酒醅在发酵过程中的微生物菌群结构。DGGE图谱分析显示，随着发酵时间的延长，酒醅中的微生物多样性不断降低；发酵结束时Lactobacillus manihotivorans成为最主要的优势菌种。16S rRNA克隆文库的测序结果在数据库中进行比对后表明，浓香型和芝麻香型酒醅中的微生物种属存在巨大差异，仅有Weissella、Bacillus、Acetobacter和Lactobacillus 4个属的微生物在两个文库中均能检测到，发现并鉴定出在白酒曲药和酒醅的研究中尚未报道的细菌属。

泸州唐玉明等以郎酒厂第4次酒入窖糟醅正常生产窖池为研究对象，研究发酵过程窖池糟醅中不同空间位置的微生物区系的动态分析。结果表明，酱香型白酒糟醅发酵过程糟醅上、中、下层不同层面的各类微生物区系在数量上存在一定差异，总的分布趋势为上层高于中、下层，兼性厌氧细菌及其芽孢杆菌的数量分布亦是上层略高于中、下层。

茅台集团与相关科研院所合作，致力于对酿造茅台酒的独特资源进行研究。与中科院微生物所共同合作，对茅台大曲和茅台酒醅中的微生物体系这一酿造茅台酒的独特资源进行研究，共分离鉴定出79种微生物，并建立了我国第一个白酒微生物菌种资源库。与天津科技大学合作，用高温富集法从太空搭载的茅台酒大曲中筛选到3株在50℃以上可旺盛生长的霉菌，通过归属鉴定，它们分别为Gilmaniella、Gilmaniella和Absidia；最适生长温度分别为50℃、50℃和45℃，最适pH分别为4.0、4.0和4.5，热致死温度分别为70℃、70℃和65℃。