原位分子杂交的基本原理和过程

原位分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一，是核酸分子杂交技术中的一种。原位分子杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术。

（一）原位分子杂交的基本原理

原位分子杂交的基本原理是，含有互补序列的标记DNA或RNA片段（即探针）在适宜条件下与细胞内的DNA或RNA形成稳定的杂交体。原位分子杂交具有敏感性高、特异性强、在组织细胞原位显示某种特定基因的表达、定位。

（二）原位分子杂交的主要过程

尽管原位分子杂交有很多种方法，但基本操作程序都包括组织的取材、固定、预杂交、杂交、冲洗和显色等步骤。由于原位杂交的检测对象是组织细胞的DNA或RNA，因此在取材、固定及标本处理方面有一些特殊的要求。

1.取材　组织应尽可能新鲜。为避免外源性RNA酶引起靶组织中RNA的丧失，取材时必须戴手套。

2.固定　进行原位分子杂交的组织必须经过化学固定剂固定。其目的在于避免组织中核酸的降解，保存组织的形态结构，对核酸与探针的杂交过程无阻碍作用。4%多聚甲醛是原位杂交应用最为广泛的固定液之一，它能很好地保持组织或细胞内的RNA，一般固定15～30minRNA的含量比较恒定。

3.标本制备　常用的原位杂交标本有石蜡切片、冰冻切片。无论采用哪一种标本，在制备时要尽量避免RNA酶的污染。载玻片要先用酸洗涤，再用蒸馏水冲洗、凉干。将载玻片涂防脱片剂多聚赖氨酸（PLL），备用。

4.杂交前处理　杂交前处理的目的在于提高组织的通透性。为了促使核酸探针与待测组织切片内的核酸序列结合，以及防止组织对DNA或RNA的非特异杂交，需要进行预杂交处理。常用的有蛋白酶K或稀酸等。蛋白酶K的纯度、浓度、消化的时间在不同的组织细胞中相差极大，因此，必须进行一系列的预试验，找到适当的浓度及消化时间。杂交前的组织处理中加入去垢剂Triton-X100，也可改变细胞的通透性。

5.杂交　进行杂交反应时，所用的探针可以是双链的DNA（dsDNA）也可以是单链的DNA（ssDNA）或为RNA。杂交反应温度一般在42℃，甲酰胺浓度50%。