检测细胞膜蛋白的流动性及蛋白质核转位

（一）实验目的及原理

检测细胞膜蛋白的流动性或胞浆蛋白进行细胞核转位的情况。一些标本或标本的不同部位如：细胞核膜、内质网和细胞质等，荧光恢复的速度非常快，荧光漂白与恢复几乎同时发生。而使用FRAP观察微观动力学的过程中，必须分为漂白和漂白后两个过程，两个过程之间的转换存在时间延迟，所以FRAP实验无法实现这些快速变化标本的动力学研究。荧光漂白丢失（fluorescence lose in photobleach，FLIP）与FRAP类似，同样在细胞上选取局部刺激区域，用强激光反复刺激，不同之处是FRAP记录的是被漂白区域的荧光恢复过程，而FLIP记录的是未被漂白区域的荧光损失过程，该技术为检查内质网、细胞核和细胞质等区室的边界提供了强有力的工具。

本部分以信号转导和转录激活因子3（nuclear receptor-mediated signal transduction pathway 3，STAT3）核转位检测为例。

（二）主要实验材料

GFP-STAT3全长质粒、转染试剂，共聚焦专用petri培养皿等。

（三）实验流程（以WI-38细胞为例）

1.细胞在共聚焦专用培养皿中培养，生长50%融合。

2.WI-38转染GFP-STAT3，孵育48h。

3.置于60倍油镜观察区域及层面，用LSCM观察GFP染色的细胞的某一层面的荧光图像。

4.根据实验需要设定扫描时间（如果恢复快速则时间间隔小一点，如果恢复慢则时间间隔长一些）。

5.以OlympusFV1000为例，按光刺激按钮；选中MAIN；选中ROI选择键；在图像上选择需要漂白的区域；选中用于漂白的激光器，一般只选405nm激光，并根据漂白情况选择漂白激光强度；输入需要漂白的时间或幅数，根据实际漂白效果，如果很快漂白则输入值低一些，如果漂白慢则输入值大一些；输入等待FRAM数，一般输入1～10个都可。

6.执行XYT扫描，SIM扫描的好处在于，可以一边执行XYT扫描，一边进行光刺激，在XYT扫描的过程中还可以调节光刺激的位置和强度等，而且可以不间断的成像。

7.获取图像和数据，计算荧光丢失速率，间接反映STAT3入核的速率。见图1-40。

图1-40　FLIP模式图

（四）典型举例

运用该技术发现衰老WI-38细胞STAT3-GFP核转位速率减慢，见图1-41。

图1-41　转染GFP-STAT3的WI-38细胞（×600）及FLIP荧光淬灭曲线分析

（五）注意事项

1.细胞的选择　在荧光显微镜下尽量选择细胞密度不大（能分出细胞个数、不相连的细胞）、细胞形态完整（不畸形，反映细胞状态良好），GFP荧光不是很强的细胞。

2.同一培养皿的细胞尽量在30～40min扫完，否则由于细胞暴露在空气中时间过长将影响检测结果，或者选择配有活细胞培养系统的共聚焦显微镜。

3.淬灭时间不能过长，否则细胞内荧光消耗过度、不易恢复，影响实验结果的准确性。