中性粒细胞碱性磷酸酶染色

（一）钙-钴染色法

【原理】　中性粒细胞碱性磷酸酶（neutrophilic alkaline phosphatase，NAP）存在于成熟的中性粒细胞（指杆状核和分叶核）胞质内，在碱性环境中能水解β-甘油磷酸钠，释放出磷酸钠。磷酸钠与硝酸钙结合形成不溶性的白色磷酸钙，磷酸钙再与硝酸钴和硫化铵作用生成棕黑色的硫化钴，位于酶活性处。反应简式如下：

【试剂】

1.10%固定液甲醛10ml，甲醇90ml混合，置4℃冰箱保存备用。

2.温育液3%β-甘油磷酸钠5ml，2%巴比妥钠水溶液5ml，2%硝酸钙10ml，蒸馏水10ml，调节pH值至9.4（调节pH用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸）。

3.2%硝酸钙水溶液。

4.2%硝酸钴水溶液。

5.1%硫化铵水溶液。

6.2%巴比妥钠水溶液。

7.0.5%伊红水溶液。

【操作方法】

1.新鲜干燥涂片标本放入10%甲醛甲醇中固定10min，流水冲洗，晾干。

2.置于37℃温育液中温育4～6h，流水冲洗后晾干。

3.滴加2%硝酸钴溶液作用5min，流水冲洗。

4.再滴加1%硫化铵溶液作用5min，流水冲洗，晾干。

5.用0.5%伊红溶液复染3min，或用2%甲绿复染3min，流水冲洗，晾干镜检。

（二）Kaplow偶氮偶联染色法

【原理】　成熟中性粒细胞内的碱性磷酸酶在pH9.6的条件下能水解温育液中的α-磷酸萘酚钠，释放出α-萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色偶氮染料沉淀，定位于胞质酶活性处。其反应过程如下：

【试剂】

1.10%固定液 甲醛10ml、甲醇90ml混合置于4℃冰箱保存。

2.0.05mol/L缓冲液 2-氨基-2甲基-1，3丙二醇2.628g，蒸馏水500ml，混匀保存于4℃冰箱中。

3.温育液 α-磷酸萘酚钠35mg溶于0.05mol/L缓冲液35ml中，再加入重氮盐坚固蓝B（B盐）35mg溶解。

4.复染液 1%苏木精水溶液或0.2%核固红水溶液。

【操作方法】

1.新鲜干燥涂片放入10%固定液中固定30s（4℃），流水冲洗后晾干。

2.放入温育液中，置于37℃水温箱内30min，流水冲洗2min，晾干。

3.置1%苏木精溶液中复染2min或置于0.2%核固红水溶液中复染5min，流水冲洗后晾干。

【结果】

1.染色结果 阳性反应为胞质内灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀。阳性反应及积分参考标准：阴性反应为0分（-）；胞质1/4以下区域出现灰褐色或少量棕黑色沉淀为1分（＋）；胞质1/2区域出现灰褐色至棕黑色沉淀为2分（）；胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，约占3/4的区域为3分（）；胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核为4分（）。

2.积分计数法 观察100个成熟中性粒细胞，按以上标准评分，算出阳性率及积分。

阳性率（%）＝（＋）＋（）＋（）＋（）；

积分＝（＋）×1＋（）×2＋（）×3＋（）×4。

3.参考值 成熟中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）积分值：钙-钴法为7～51分；Kaplow偶氮偶联法为40～80分。阳性率：30%～50%。该值因各实验室条件不同而有差异。

【临床意义】

1.生理性变化 ①年龄：新生儿NAP活性甚高，婴幼儿及儿童期略高于成年人，老年期降低；②应激状态：紧张、恐惧、激烈活动等NAP活性可增高；③月经周期：经前期增高，行经后降低，经后期恢复正常；④妊娠：妊娠2～3个月时NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后恢复正常。

2.病理性变化 ①感染，细菌性感染时NAP积分值增高，球菌较杆菌感染为高，急性感染较慢性感染为高，病毒感染时NAP积分值减低。②类白血病反应NAP积分值明显增高。③慢粒慢性期（无继发感染者）NAP积分值显著减低，缓解期恢复正常，加速期和急变期增高。④急性白血病，急性髓细胞白血病NAP积分值减低，急性淋巴细胞白血病时一般增高。⑤再生障碍性贫血，NAP积分增高，阵发性睡眠性血红蛋白尿症NAP积分值减低，故可作为鉴别两者方法之一。骨髓增生异常综合征NAP积分值减低。⑥真性红细胞增多症NAP积分值增高，继发性红细胞增多症NAP积分值无明显变化。⑦其他血液病，多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、骨髓纤维化、原发性血小板增多、神经母细胞瘤、骨髓转移癌等疾病NAP积分值增高；恶性组织细胞病NAP积分值减低，反应性组织细胞增多NAP积分值明显增高。⑧应用肾上腺糖皮质激素，雌激素和ACTH后，NAP积分值增高。

【注意事项】

1.用新鲜的血涂片，标本放置过久酶活性会减低。

2.每次染色时，最好同时做一份阳性对照的血片，以确定阳性的可靠性。

3.缓冲液应先放入水浴箱中温育5min。

4.温育液中每加一种试剂后需充分混匀。