氯化还原法

13．3．5　氯化NBT还原法

13．3．5．1　原理

NBT被还原为单甲或二甲，后者为蓝紫色物质，在530～580nm均呈现最大吸收，SOD存在时，NBT还原反应受到抑制。

由于超氧自由基（）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。主要是利用各种呈色反应来测定SOD的活性。核黄素在有氧条件下能产生，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲暅（黄色），继而还原生成二甲暅，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。加入SOD，可以使与H^＋结合生成H₂O₂和O₂，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲暅生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各种溶液的吸光度值，因抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出两者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50%时的酶量作为一个酶活性单位（u）。

酶活性单位定义：在一定的实验条件下，抑制NBT还原反应的50%的酶量为一个单位。

13．3．5．2　测定方法及特点

（1）在25℃，取一定量SOD待测液，依次加入0．1mol/L的EDTa 0．2mL，1．5mmol/L的NBT 0．1mL，加入pH为7．8，0．1mol/L的磷酸钠缓冲液至总体积2．95mL，混匀，再加入0．1mmol/L核黄素0．05mL，混匀，注意避光，迅速放入内置20W荧光灯四周白色的箱内，光照10min，于560nm测定吸光度，另外不加SOD同样操作测定吸光度。

（2）方法特点：该方法利用建立的公式代替作图法，对SOD加样量与NBT还原抑制程度关系进行曲线拟合，结果发现，经双倒数转换后有极好的直线关系，相关系数达到或超过0．99。利用这种关系建立计算公式，可使计算方便、准确，避免了作图法繁琐、主观性大的缺点。

13．3．5．3　实例——鲜叶中类SOD活性的测定

（1）仪器：可见分光光度计；万分之一分析天平；高速冷冻离心机。

（2）试剂：①0．1mol/L pH为7．8的磷酸钠（Na₂HPO₄－NaH₂PO₄）缓冲液。

A液（0．1mol/L Na₂HPO₄溶液）：准确称取Na₂HPO₄·12H₂O（M_r＝358．14）3．581　4g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃下在冰箱中保存备用。

B液（0．1mol/L NaH₂PO₄溶液）：准确称取NaH₂PO₄·2H₂O（M_r＝156．01）0．780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃下在冰箱中保存备用。

取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0．1mol/L pH为7．8的磷酸钠缓冲液。4℃下在冰箱中保存备用。

②0．026mol/L甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液：准确称取L－甲硫氨酸（C₅H₁₁NO₂S，M_r＝149．21）0．387　9g于100mL小烧杯中，用少量0．1mol/L、pH为7．8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0．1mol/L、pH为7．8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃下在冰箱中保存可用1～2d。

③7．5×10^－4mol/L NBT溶液：准确称取NBT（C₄₀H₃₀Cl₂N₁₀O₆，M_r＝817．7）0．153　3g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃下在冰箱中保存可用2～3d。

④含1．0μmol/L EDTA的2×10^－5mol/L核黄素溶液。

A液：准确称取EDTA（M_r＝292）0．002　92g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

B液：准确称取核黄素（M_r＝376．36）0．075　3g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。

C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0．1mmol/L EDTA的2mmol/L核黄素溶液。4℃下在冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃下在冰箱中保存。

当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1．0μmol/L EDTA的2×10－5　mol/L核黄素溶液。

⑤0．05mol/L、pH为7．8的磷酸钠缓冲液：取0．1mol/L、pH为7．8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃下在冰箱中保存备用。

⑥石英砂。

（3）测定步骤。

酶液的制备：按每1g鲜叶加入0．05mol/L、pH为7．8的磷酸钠缓冲液3mL，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8　500r/min冷冻离心30min，上清液即为SOD粗提液。

酶活性的测定：每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表13－8加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活性进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。

表13－8　反应系统中各试剂及酶液的加入量/mL

各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25℃、光强为4　500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）光照15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液吸光度并记录结果。以2、3号杯液吸光度的平均值作为抑制NBT光还原率100%，根据其他各杯液的吸光度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出两者相关曲线。找出50%抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活性单位（u）。

结果计算：

①560nm波长下各酶液的吸光度（表13－9）

表13－9　测定数据表

以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，找出50%抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活性单位（u）。

②SOD活性按下式计算

式中，A为酶活性（酶活性单位为u/g）；V为酶提取液总体积（mL）；B为一个酶活性单位的酶液量（μL）；W为样品鲜重（g）；T为反应时间（min）；1　000为1mL＝1　000μL；60为1h＝60min。

③抑制率按下式计算：

式中，A₁为2、3号酶液的吸光度平均值；A₂为加入不同酶液量的各酶液的吸光度值。

注意：有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活性工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的吸光度值，按下式计算酶活性。

式中，A₁为2、3号酶液的吸光度平均值；A₂为测定样品酶液的吸光度；50%为抑制率50%；其他各因子代表的内容与上述SOD活性计算公式的各因子代表的内容相同。