第二章 共聚焦显微镜简介
一、组成结构
共聚焦显微镜主要由三大部分组成。
1.主机 由一个一维的扫描裂隙装置和一个与图像光路相一致的物体聚焦盘组成,可在一维的光切面上做三维的点状分层扫描。
2.光学传输系统 用于将连续的光扫描信号同步传输到计算机屏幕上显示,并将信号储存在计算机硬盘内。
3.计算机分析系统 通过系统自带的分析软件,可对记录在电脑内的图像进行分析。一般来说,不同厂商生产的共聚焦显微镜均带有厂商自主研发的分析软件,彼此之间不能互相通用或兼容。
二、类型
根据使用光源的不同,目前临床上常用的眼科用共聚焦显微镜可分为两大类。
1.以卤素灯为光源的眼科用共聚焦显微镜 目前市场上NIDEK公司生产的Confoscan(CS)系列即属这一类型(图2-1)。具有自动、半自动和手动3种不同的扫描模式。 3种模式均通过类似裂隙灯的手柄操作控制探头的前进和后退,易被眼科医师熟悉和接受(图2-2)。以自动模式为例,每次扫描可完成对角膜全层组织的来回2次扫描,扫描间隔固定为1.5μm,共可获得350幅连续动态图像。一旦扫描启动,探头自动前进和后退,无需操作者再进行调节,所以操作方便、简单易学。
图2-1 NIDEK公司生产的CS3共聚焦显微镜外观
图2-2 CS3共聚焦显微镜的控制面板和手柄按钮分布图
此外,CS系列还配有Z-scan模式,可对不同部位的组织或病变进行深度定位。除了操作简单、模式多样外,这一类型的共聚焦显微镜还具有许多优点,如放大倍率高达1 000倍,最佳分辨精度可达1μm;它的探头以凝胶为介质,与角膜表面保持约1.98 mm的安全距离,并不直接与角膜表面接触(图2-3,2-4),无创伤性,易被患者接受;部分高端产品还配有注视光源,容易控制患者眼位,使患者更好地配合检查。它的缺点是,由于以卤素光为光源,因此光源的穿透力有限,更适用于对透明角膜的观察;在角膜水肿、混浊较明显的情况下,由于光线大多在浅层组织被反射或散射,难以到达深层组织,因此深层组织不能较好显影。此外,每次检查完毕镜头表面仅能使用75%乙醇擦拭消毒,故有发生医源性交叉感染的可能。
图2-3 共聚焦显微镜检查示意图
注:CS系列共聚焦显微镜进行检查时,镜头与角膜表面不直接接触,以凝胶作为介质
图2-4 CS3共聚焦显微镜成像原理
注:探头通过凝胶为介质与角膜表面保持约1.98 mm的安全距离,在安全距离内,入射光束可聚焦在角膜组织内;如镜头与角膜距离过近,入射光束的焦点则进入前房
2.以激光为光源的眼科用共聚焦显微镜 目前市场上Heidelberg公司生产的HRTⅢ型即属于这一类型(图2-5)。它也有3种不同的图像采集方式,如单幅采集、连续线性采集和对同一观察位置的动态采集。每次扫描总深度为60μm,可获得40幅动态连续图像,每幅间隔1.5μm。与卤素灯光源的共聚焦显微镜相比,最大的优点是激光光源的穿透力强,不仅能对透明角膜进行成像,而且对水肿、混浊的角膜组织以及周边不透明组织如角巩膜缘、结膜杯状细胞和结膜滤泡(青光眼术后)等均能进行清晰成像。另外,每检查一名患者,操作者都要对镜头表面的无菌帽进行更换,故可防止医源性交叉感染。在临床应用过程中,它也有些缺点,包括需要操作者将探头旋进或后退调节成像平面,操作复杂、不易掌握;它的放大倍率为800倍,低于前一种类型;探头与患者角膜直接接触,易引起感染和不适;由于探头挤压角膜,容易导致深层组织的图像出现轻微畸变;对于角膜变薄濒于穿孔的患者不宜进行检查以免诱发穿孔。
图2-5 Heidelberg公司生产的HRTⅢ型共聚焦显微镜外观
这两种类型的共聚焦显微镜各有利弊,目前临床上均在广泛应用。但是由于目前常用的这两种共聚焦显微镜均未克服眼球运动造成图像畸变这一问题,因此该项检查对于患者的配合要求较高。
三、检查方法
两种类型的共聚焦显微镜的检查步骤相似,具体如下。
(1)检查前向受检者说明检查中需要注意的事项,取得患者的充分理解和配合。
(2)在受检眼的结膜囊内点0.5%丁卡因或者0.4%盐酸奥布卡因(倍诺喜)1滴,稍待片刻后,用弹簧开睑器开睑。
(3)嘱患者将下颌放于托架上,额部顶靠托架上方的头带,以保持头位与显微镜探头的垂直。
(4)如为CS系列共聚焦显微镜,在浸锥式镜头上涂适量透明的黏稠物质(如唯地息凝胶),作为镜头与角膜表面的耦合剂和成像介质。如为HRTⅢ共聚焦显微镜,在镜头表面涂布唯地息凝胶后,再在镜头前套上1个一次性无菌帽,并注意无菌帽内壁与镜头之间的唯地息分布均匀,没有空隙或气泡。
(5)通过调节主机上的手柄,使镜头上的耦合剂与角膜表面接触(CS系列)或带有一次性无菌帽的镜头与角膜直接接触(HRTⅢ)。通过前后移动Joystick手柄(CS系列)或者手动将探头旋进或后退,调节成像焦点平面,使角膜各层图像通过计算机屏幕快速显示。
(6)选择适当的图像采集模式,将所需的图像记录于电脑中。
(7)利用系统自带的分析软件,对采集的图像进行分析。
检查时需注意以下几点。
(1)镜头上涂布的耦合剂量要适中,太多易流失,太少影响成像质量和图像清晰度。
(2)一般每次至少检查2个点,以提高阳性率。
(3)每次检查完毕要用75%乙醇对镜头表面进行擦拭消毒(CS系列)或者更换一次性无菌帽(HRTⅢ),使用后的开睑器也必须用75%乙醇擦拭消毒,每周再集中使用0.2%戊二醛浸泡一次,以防止交叉感染。
四、适应证和禁忌证
1.适应证
(1)观察角膜各层细胞的变化。
(2)角膜感染性疾病的无创性快速诊断。
(3)角膜移植术和角膜屈光手术的术前、术后定量检测,观察角膜各层细胞、组织结构和神经的创伤愈合。
(4)观察泪膜的变化,评价干眼症患者的泪膜和角膜状态。
(5)各种角膜变性和角膜营养不良的形态学检测。
(6)对角膜、结膜烧伤后,患者的角膜、结膜和角膜缘干细胞的形态观察、随访。
(7)对接触镜佩戴者的角膜状态、角巩膜缘结构进行随访。
(8)对角膜、结膜的朗格汉斯细胞和结膜杯状细胞的形态学观察和数量随访。
(9)角膜、结膜肿瘤的辅助诊断。
(11)视网膜手术后角膜内硅油沉积颗粒的观察。
2.禁忌证
(1)眼球震颤,无法固视者。
(2)对表面麻醉剂(丁卡因、奥布卡因)过敏者。
(3)因各种原因造成的睑裂过小(如化学伤后),无法放置开睑器者。
(4)结膜囊内有活动性炎症并具有传染性者(不宜使用CS系列检查)。
(5)角膜溃疡、变薄,濒于穿孔者(不宜使用HRTⅢ检查)。
(6)眉弓突出、眼窝较深者,因容易造成镜头与角膜不能充分接触,所以初学操作、经验不丰富者不宜对此类患者进行检查。
(乐琦骅 洪佳旭 徐建江)
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