极谱氧电极法

13．3．4　极谱氧电极法

13．3．4．1　原理

利用产生系统——肾上腺素自氧化产生。在密闭酶反应室中，肾上腺素自氧化的反应会使反应室内的氧气逐渐消耗。当肾上腺素自氧化一段时间（如0．5min）产生一定量的后，加入一定量的SOD，SOD会把歧化成H₂O₂和O₂，产生的氧气使反应室中的氧量增加，增加的程度与加入的SOD量成正比。由于肾上腺素自氧化可产生，而SOD却可分解，但如果在一个体系的话，表观上看来似乎SOD有抑制肾上腺素自氧化的作用，抑制程度取决于SOD量的多少，因此在氧电极法测定SOD活性时也可在反应室中的肾上腺素自氧化一开始便加入SOD以视氧气消耗的多少来测定SOD活性，耗氧量可用极谱氧电极测出。加入一定量SOD会使肾上腺素自氧化耗氧量减少，由于后者的多少与SOD量有关，故可测出样品中SOD活性。

13．3．4．2　仪器及试剂

（1）仪器：测氧仪及氧传感器、磁力搅拌器、流动恒温反应池（见图13－2）。

（2）试剂：①10mmol/L盐酸溶液。②0．05mol/L肾上腺素，用上述盐酸溶液配制。③0．1mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA）。④0．1mol/L NaHCO₃－Na₂CO₃缓冲液，pH为10．5。

13．3．4．3　步骤

（1）肾上腺素自氧化速率测定。①向测量池夹层中通入25℃恒温水。②在15mL测量池中加入0．1mol/L NaHCO₃－Na₂CO₃缓冲液（pH为10．5）9mL，0．1mol/L EDTa 1mL。③将氧传感器插入测量池内，用磁力搅拌器匀速搅拌至测氧仪指示数字稳定，记录初值A₀（溶解氧值）。④加入0．05mol/L的肾上腺素溶液100μL，由于肾上腺素的自氧化，测量池内溶氧含量降低，每间隔1min测定1～5min即时值A₁、A₂、…、A₅，计算肾上腺素自氧化平均速率ΔA_对照/min（氧耗速率）。

图13－2　极谱氧电极测定用酶反应室

a．恒温套管，箭头为循环水进、出口；b．反应室塞；c．密闭塞；d．密封橡皮圈；e．氧电极；f．反应腔

（2）样品SOD活性测定。①测量池恒温于25℃。②在15mL测量池中加入0．1mol/L NaHCO₃－Na₂CO₃缓冲液（pH为10．5）8．99mL，0．1mol/L EDTa 1mL，另外加入待测样品液10μL。③将氧传感器插入测量池内，匀速搅拌至测氧仪读数稳定。④加入0．05mol/L肾上腺素溶液100μL，由于样品液中SOD酶的存在，抑制了肾上腺素的自氧化，使其自氧化速率减慢，亦即单位时间内氧消耗速率减慢，每间隔1min测定1～5min即时值A₁、A₂、…、A₅，计算肾上腺素自氧化平均速率ΔA_对照/min（氧耗速率）。

（3）酶活性计算。酶活性单位定义：在规定的测定条件下，在1mL反应液中，每1min抑制肾上腺素自氧化速率为50%酶量定义为1个活性单位。

SOD比活（u/mg蛋白）＝单位体积SOD活性（u/mL）/样品蛋白质浓度（mg/mL）

13．3．4．4　注意事项

（1）本法测定中，在肾上腺素自氧化过程的初始阶段（1～5min内），氧含量下降速度与时间呈线性关系，在测定条件下，0．05mol/L肾上腺素自氧化的耗氧速率平均值约为4．0/min。

（2）若测定时样品SOD抑制肾上腺素自氧化速率在35%～65%，结果较为准确，因此应通过调节待测样品的稀释倍数，使稀释后的样品对测定体系中肾上腺素自氧化速率的抑制率约为35%～65%。

（3）产生体系可用0．06mol/L的连苯三酚自氧化等代替，测定原理及方法与此相同。

（4）本法是测定SOD活性的快速方法，特点是取样少，检测灵敏度高，速度快，可用于Down’s综合征等的产前诊断等。