超速离心法

14．2．3　超速离心法

（1）原理。蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力的作用时，如果其密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和黏度有关。超速离心法就是利用强大的离心场（60　000～80　000r/min时，对于质量为1g的物质，位于10cm处的分子受到的离心场相当于重力加速度的400　000～700　000倍）来分析生物大分子的。

利用超速离心法还可测定蛋白质的M_r。常用的有两种方法：一种是沉降速率法，另一种是沉降平衡法。

超速离心法不仅可以提供蛋白质M_r的数据，而且还可以作为鉴定蛋白质均一性的方法。纯的蛋白质溶液中只含有相对分子质量和形状相同的蛋白质分子，在离心场的作用下，它们都以同一沉降速度移动，因此在蛋白质溶液与溶液和溶剂之间有一清晰的界面，在沉降分析图谱上呈现一个峰。如果蛋白质样品不纯而含有几种蛋白质，在沉降分析图谱中就有几个峰出现。

（2）仪器：超速离心机。

（3）试剂：样品溶液。

（4）操作方法：一般按照超速离心机的规程操作，在此不作详细介绍。

图14－7　tsSOD的沉降速率分析

（沉降系数为5．5s，相对分子质量约为100kD）

（5）应用举例：Yong－zhi He等在研究一种新基因编码的高度耐热的Fe－SOD时，运用超速离心方法对热稳定SOD（tsSOD，thermol stable SOD）进行分析。分析条件：仪器为Beckman Optima XLA分析超速离心机（An60Ti转子）；280nm紫外检测；样品为利用Superdex 200　10/30GL新纯化的重组tsSOD；沉降缓冲液为含100mmol/L NaCl的100mmol/L磷酸盐缓冲液，pH为7．0）；tsSOD加样400μL（1mg/mL）；转速42　000r/min；沉降温度20℃；沉降时间：5h。分析结果如图14－7所示。结合其他试验的分析结果，证明tsSOD是三聚体形式。