-酚试剂法（法）

二、Folin-酚试剂法（Lowry法）

（一）实验目的

1．了解Folin-酚试剂法定量测定蛋白质的基本原理。

2．掌握Folin-酚试剂法定量测定蛋白质的实验方法。

（二）实验原理

Folin-酚试剂法又名Lowry法，是双缩脲法的发展。Folin-酚试剂由甲、乙两部分试剂组成。甲试剂使蛋白质中的肽键在碱性条件下，生成紫红色络合物，相当于双缩脲反应。乙试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色（钼蓝、钨蓝混合物），其颜色深浅与蛋白质含量成正比，因此通过比色可测定蛋白质的浓度。

此方法比双缩脲法灵敏100倍，较紫外分光光度法灵敏10～20倍。

（三）实验药品、实验设备

1．血清：人血清，使用前稀释100倍。

2．0.5g/L酪蛋白标准液：称取酪蛋白125.0mg，用0.1mol/L氢氧化钠溶解后，加蒸馏水定容至250mL。

3．Folin-酚试剂：

甲试剂：（1）称取无水碳酸钠（Na₂CO₃）2g，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL，混匀。（2）称取五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.5g，加入1％酒石酸钾钠溶液100mL，混匀。使用前，将（1）与（2）按50∶1混合即成碱性硫酸铜溶液。混合后，试剂只能使用1天。

乙试剂：在2L磨口回流装置内加二水合钨酸钠（Na₂WO₄·2H₂O）100g，二水合钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）25g，蒸馏水700mL，14.68mol/L（85％），磷酸50mL，浓盐酸100mL充分混合后用小火回流10h。冷却后，再加硫酸锂（Li₂SO₄）150g，蒸馏水50mL，液溴数滴，然后开口沸腾15min，以驱除过量溴。注意：溴气有毒，要在通风橱中进行。冷却后用蒸馏水定容至1000mL，过滤，滤液为淡黄色，置于棕色瓶中，可在冰箱内长期保存。若滤液变绿，可加液溴几滴，煮沸数分钟至溶液恢复淡黄色即可。乙试剂使用前，用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，标定乙试剂酸度，使用时适当稀释（约1倍），使最终酸浓度为1mol/L，这样就制成为乙试剂工作溶液。置于冰箱中长期保存。

4．分光光度计。

5．电热恒温水浴箱。

6．15mm×150mm试管9支。

7．0.5mL、1mL、5mL刻度吸管。

8．试管架。

9．容量瓶。

（四）实验方法

1．标准曲线绘制

取7支试管编号，按表2-11所示顺序和剂量加入各试剂，迅速混匀，在20～25℃（或室温下）放置30min，用分光光度计在波长500nm下，以“0”管试液作参比，测定各管吸光度。

以各吸光度为纵坐标，各标准蛋白浓度为横坐标，绘制吸光度-蛋白质浓度标准曲线。

表2-11　标准曲线的绘制

2．血清测定

取两支试管编号，按表2-12所示顺序和剂量加入试剂。

表2-12　血清中蛋白质浓度的测定

迅速混匀，于20～25℃（或室温）下放置30min，用分光光度计在波长500nm下，以空白管试液作参比，测定测定管吸光度。

3．结果处理

根据测定管吸光度，在标准曲线上查出对应的标准蛋白质的浓度，再乘以稀释倍数，即为血清中蛋白质浓度。

4．注意事项

（1）Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，在加入到碱性的铜离子-蛋白质溶液中时（pH值约为10），必须立即混匀，以便在磷钼酸、磷钨酸试剂破坏之前，即发生还原反应。

（2）本法受多种因素干扰，凡对双缩脲反应起干扰作用的基团以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲液均可干扰Folin-酚反应。

（3）所测蛋白质样品中，若含酚类及柠檬酸也干扰Folin-酚反应。在测试时应排除干扰因素或做空白试验。

（五）实验记录

1．吸光度-蛋白质浓度标准曲线的绘制：

2．实验记录：

（六）思考题

1．根据Folin-酚测定蛋白质的原理，哪些因素可干扰蛋白质含量的测定？

2．作为标准蛋白应有何要求？