经典连苯三酚自氧化法（改良法）

13．2．2　经典连苯三酚自氧化法（改良Marklund法）

13．2．2．1　原理

基于经典的分光光度法，采用化学法代替脉冲辐射分解法产生，简化了实验条件。在碱性条件下，连苯三酚会发生自氧化生成红橘酚，同时生成，连苯三酚的自氧化速率与的浓度有关。SOD能催化发生歧化反应生成H₂O₂和O₂，从而抑制连苯三酚的自氧化。样品对连苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD的含量。

13．2．2．2　仪器及试剂

（1）仪器：分光光度计

（2）试剂：①54mmol/L Tris－二甲胂酸钠－HCl缓冲液：含54mmol/L Tris－HCl、54mmol/L二甲胂酸钠、1．07mmol/L二乙烯三胺五乙酸，pH为8．2；②10mmol/L盐酸；③6mmol/L连苯三酚：用10mmol/L盐酸配制。

13．2．2．3　步骤

（1）调整连苯三酚自氧化速率，按表13－3加样（单位：mL）。具体操作如下：试管加入缓冲液，限25℃，保温10min，加入25℃预热的连苯三酚，迅速摇匀，倾入1cm比色杯中，在420　nm下，每隔30s测吸光度值一次，自氧化速率在3min内有效。调整连苯三酚用量，使线性范围内吸光度值的变化速率控制在0．020/min（见表13－3）。

表13－3　测定连苯三酚自氧化速率的试剂用量表

（2）样品测定：将上表中的双蒸水换成等体积的待测SOD样品液，测定步骤同（1）中描述，在420nm下每隔30s测吸光度值一次，计算平均每1min的吸光度变化值ΔA420nm/min。控制SOD样品液的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定体系后，连苯三酚自氧化速率的吸光度值平均每1min下降0．01，即连苯三酚自氧化速率被抑制50%左右。

（3）酶活性计算：SOD活性单位定义为，在规定条件下，1mL反应液中每1min抑制连苯三酚420nm下自氧化速率达50%时的酶量为1个酶活性单位（u）或称Marklund单位。样品液中每1mg蛋白质中的SOD活性单位数成为样品液的SOD比活（u/mg）。

按以下公式计算：

样品SOD比活（u/mg蛋白）＝单位体积活性（u/mL）/c_Pr式中，V_总——反应总体积3（mL）；V_样——加入样品液的体积0．1（mL）；V定义——酶活性单位定义体积1（mL）；c_Pr——样品液蛋白质含量（mg/mL）。

13．2．2．4　注意事项

（1）Marklund最早建立了实用的测定SOD活性的分光光度法，其对经典的分光光度法进行了如下改进：用化学法代替脉冲辐射分解法产生；提高测定液的pH值，使的自动歧化反应速度降低，从而延长了测定时间，增至数十秒；痕量金属可能催化自动歧化反应速度，加入金属螯合物二乙烯三胺五乙酸排除样品中过渡金属离子的干扰，提高测定结果的准确度。此法专一性强，灵敏度可达1×10－10　mol/L SOD。

（2）最初的Marklund法中用以产生的方法是：将50～100mg KO₂溶解于25mL冰冷的50mmol/L NaOH与0．5mmol/L二乙烯三胺五乙酸，使的理论产量达到40mmol/L。但用此法制备的不易维持稳定浓度，因此该法不易掌握。

（3）歧化反应产物H₂O₂可使SOD失活，可加入适量过氧化氢酶予以清除。

（4）测定的420nm光吸收常为很低水平，测定结果的准确性可能受到影响。