细胞骨架标本的制备与观察

实验七　细胞骨架标本的制备与观察

细胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化、物质运输、能量转换、信息传递及基因表达等起重要的作用。

一、实验目的

（1）掌握考马斯亮蓝R250染细胞胞质微丝的方法。

（2）了解细胞骨架的结构特征。

二、实验原理

当用适当浓度的TritonX－100处理细胞，可抽提细胞质内结合在膜结构上的蛋白质，而仅保留骨架蛋白。经戊二醛固定，用蛋白质的特异性染料——考马斯亮蓝R250染色后，各种细胞骨架蛋白质着色，可在光学显微镜下观察到由微丝蛋白组成的微丝束为网状结构。

三、实验用品

（1）材料：洋葱鳞茎。

（2）器材和仪器：光学显微镜、恒温水浴锅、50ml烧杯、滴管、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、吸水纸、擦镜纸。

（3）试剂：2%考马斯亮蓝R250染色液，pH　6.5磷酸缓冲液（PBS），M缓冲液（pH　7.2），1%Trion　X－100，3%戊二醛。

四、实验内容

（1）取材：切开洋葱鳞茎，取较内层的鳞叶一小块，用镊子撕下内表皮细胞（约1cm²大小若干片），浸入装有pH　6.5磷酸缓冲液（PBS）的烧杯中，处理5～10min。

（2）抽提：吸去PBS，加2ml　1%TritonX－100，将烧杯置于37℃恒温水浴锅中处理20～30min。

（3）冲洗：吸去TritonX－100，用M－缓冲液洗3次，每次5min。

（4）固定：加3%戊二醛固定20min。

（5）冲洗：弃固定液，用PBS洗3次，每次5min。

（6）染色：吸去PBS，加5滴0.2%考马斯亮蓝R250，染色10min。

（7）制片：倒去染液，用蒸馏水洗涤2～3次，将标本平铺在载玻片上，加盖玻片。于普通光学显微镜下观察。

（8）结果：光镜下洋葱内表皮细胞轮廓清晰，细胞内可见粗细不等的深蓝色纤维网络结构，即细胞骨架纤维束（图7－1）。

图7－1　光镜下洋葱鳞茎表皮细胞（示细胞骨架纤维）

五、作业与思考题

（1）绘出植物细胞骨架微丝结构图。

（2）本实验中所使用的TritonX－100、戊二醛、考马斯亮蓝R250等试剂的作用是什么？