各种酶类试验

四、各种酶类试验

(一)氧化酶试验

1．原理　　氧化酶又称细胞色素氧化酶。某些细菌具有氧化酶，可使细胞色素C氧化，此氧化型细胞色素C可与氧化酶试剂产生颜色反应。

2．方法　取滤纸片蘸取待测菌落少许，加氧化酶试剂(10 g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液)1滴，观察颜色变化。阳性者呈红色，呈色高峰时，颜色为深紫色(彩图10)。结果应在10 s内观察，时间延长将导致部分氧化酶阴性细菌显色，从而造成假阳性结果。

3．应用　主要用于非发酵菌与肠杆菌科的鉴别，前者除嗜麦芽窄食单胞菌、不动杆菌外均为氧化酶阳性，后者氧化酶阴性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。

(二)触酶试验

1．原理　　触酶试验又称过氧化氢酶试验，产生过氧化氢酶的细菌能使过氧化氢分解为分子态氧和水，出现气泡。

2．方法　挑取待检菌落，置于洁净玻片上，滴加新鲜配制的3%过氧化氢1滴，立即观察结果。触酶阳性菌多于10 s内出现大量气泡，而触酶阴性菌不产生气泡或于10 s后产生少量气泡(彩图11)。注意此试验不宜使用血平板上的菌落，因红细胞细胞膜中含有过氧化氢酶，会导致假阳性反应。如使用，应尽量避免刮到培养基中的红细胞。

3．应用　常用于革兰阳性球菌的初步分群。葡萄球菌和微球菌为阳性，而链球菌属呈阴性。

(三)凝固酶试验

1．原理　　金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变成为纤维蛋白，血浆形成凝块。凝固酶有两结合型和游离型，前者用玻片法检测，后者用试管法检测。

2．方法　①玻片法:取1滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，观察有无自凝现象。然后加一环新鲜血浆混合，10 s内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性(彩图12)。如超过10 s可出现假阳性。有10%～15%的金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证。②试管法:取0．5 mL新鲜血浆，然后挑取3～5个菌落于血浆中混匀，置37℃水浴，3～4 h读取结果，见到明显凝胶状为阳性，若无凝固则继续观察24 h，仍无凝固则为阴性。试验应同时做阳性和阴性对照。

3．应用　主要用于致病性葡萄球菌的鉴定。

(四)硝酸盐还原试验

1．原理　　某些细菌可将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，后者与乙酸作用生成亚硝酸，亚硝酸再与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再与α－萘胺结合成红色的N－α萘胺偶氮苯磺酸(红色化合物)。

2．试剂硝酸盐试剂(甲液:对氨基苯磺酸0．8 g，5 mol/L醋酸;乙液:α－萘胺0．5 g，5mol/L醋酸)

3．方法　将待检菌株接种于硝酸盐培养基，35℃孵育1～2 d，加入试剂甲液和乙液各2滴，立即观察结果。若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否被还原。可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在;若仍不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮。

4．应用　用于肠杆菌科和假单胞菌属细菌的鉴定。

(五)DNA酶试验

1．原理　　有些细菌能产生DNA酶，可使DNA长链水解成寡核苷酸链，DNA长链可被酸沉淀，而寡核苷酸链则可溶于酸，无沉淀生成。

2．方法　于DNA琼脂平皿上点状接种待检菌，35℃培养18～24 h，用1 mol/L盐酸倾注平皿，观察结果。菌落周围产生透明环为阳性，无透明环为阴性。

3．应用　用于沙雷菌属、变形杆菌属、葡萄球菌属的鉴定，三者DNA酶试验应皆为阳性。

(六)卵磷脂酶试验

1．原理　有些细菌能产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，形成浑浊沉淀状的甘油酯和水溶性磷酸胆碱。

2．方法　将待检菌划线接种于卵黄琼脂平板上，于35℃培养3～6 h。产生卵磷脂酶的细菌，培养3 h后，在菌落周围形成乳白色混浊环，6 h后扩散至5～6 mm。

3．应用　主要用于某些厌氧菌的鉴定。产气荚膜梭菌和诺维梭菌为阳性，其他梭菌为阴性。蜡样芽孢杆菌亦为阳性。

(七)CAMP试验

1．原理　B群链球菌产生的“CAMP因子”，可促进葡萄球菌β溶血素溶解红细胞的活性。

2．方法　将有明显溶血的金黄色葡萄球菌于羊血平板上做一横线接种，再将待检菌垂直于该线划线接种，二者相距2～5 mm，35℃培养18～24 h。被检菌接种线靠金黄色葡萄球菌接种线一端有一扩大的矢状溶血区为阳性。无加强溶血区出现，则为阴性。

3．应用　CAMP试验主要用于B群链球菌的鉴定。

(八)胆汁溶菌试验

1．原理　胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，一方面是由于胆汁可降低表面张力，使细胞膜破损或使菌体裂解;另一方面胆盐能促进肺炎链球菌自溶酶对自身的溶菌作用。

2．方法　①试管法:取待检菌18～24 h培养物1 mL，加入10%去氧胆酸钠溶液0．1 mL或纯牛胆汁0．2 mL;另取同一培养物1 mL与生理盐水0．1 mL混合于另一试管作对照。混匀后置35℃水浴箱10～15 min后观察结果。如果加胆盐管的培养物变透明，对照管仍均匀浑浊，则表明试验菌已被胆盐所溶解。②平板法:取10%去氧胆酸钠溶液l环，滴加于血琼脂平板被检测菌的菌落上，置35℃30 min后观察结果。如果菌落消失或变扁平，则为阳性，菌落无改变者为阴性(彩图25)。

3．应用　主要用于肺炎链球菌的鉴定。