直接凝集反应

实验7　直接凝集反应

(Direct cohesion reaction)

【目的】

了解直接凝集反应的操作过程、结果判断及实际应用。

【原理】

颗粒性抗原(如细菌、红细胞等)的混悬液在电解质存在的条件下，与相应抗体结合，由此产生大小不等的凝集团块现象，称作凝集反应(agglutination)。

凝集试验是以凝集反应为原理的检测技术。凝集试验一般为定性检测方法，即根据凝集现象出现与否判定待测的抗原或抗体是否存在;它也可作为半定量检测手段，即将待测标本作一系列倍比稀释后进行反应，用出现＋＋阳性反应的最高稀释度作为被检物质的效价。

凝集反应中的抗原称为凝集原(agglutinagen)，抗体称为凝集素(agglutinin)。

根据不同的方法，直接凝集试验又可分为试管法凝集试验与玻片法凝集试验两种。

一、试管法凝集试验

试管法凝集试验是一种定量的试验方法，是用已知抗原检测待测血清是否有相应抗体，且可测出相应抗体的量，以辅助诊断某些疾病。根据每管内的凝集程度，判定待检样品中相应抗原或抗体的有无及其效价。试验中由于电解质浓度或pH值不适宜等原因，可引起抗原非特异性凝集，出现假阳性反应，所以应设立阴性对照管。

【材料】

1.“O”型或“H”型伤寒杆菌菌液。

2.伤寒杆菌免疫血清，按其效价用生理盐水稀释为1∶20。

3.生理盐水。

4.小试管、试管架、吸管等。

【方法】

1.取小试管7支，置于试管架上，编号。

2.除第1管外，2～7管分别用1ml刻度吸管吸生理盐水，每管各加0.5ml。

3.在第1管和第2管中分别用1m l刻度吸管吸取伤寒杆菌免疫血清(1∶20) 0.5m l。

4.在第2管的1∶20伤寒杆菌免疫血清与生理盐水充分混匀后，用1ml刻度吸管吸取0.5ml移至第3管中，反复吹吸3次，使之与盐水混匀，再吸出0.5ml注入第4管。如此倍比稀释至第6管，第6管中移出的0.5ml弃去，在第7管不加血清作为对照。稀释完后，每管中的液体总量均为0.5ml，但血清稀释度不同，1～6管分别为1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640。

5.取O型或H型伤寒杆菌菌液，分别加入上述各管，每管0.5m l，于是各管血清稀释倍数又增加了一倍。即最后稀释度，1～6管分别为1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280。

6.将各管振荡均匀使菌液与血清充分混匀，放入37℃温箱中过夜，次日观察结果。

具体稀释方法可参阅表7-1。

表7-1　试管定量凝集反应加样程序

【结果观察及判定标准】

1.观察方法:从温箱中轻轻取出试管架，不要摇动试管。先观察对照管(第7管)，此管不出现凝集现象，正确的结果是管底沉淀物呈圆形，边缘整齐，轻轻振荡细菌迅速分散呈均匀混浊，如出现凝集，则实验有误应该重做。然后自第1管向后观察。若使用的为O型伤寒杆菌菌液，出现凝集时，凝集物呈现颗粒状，轻摇不易升起和离散;若使用的为H型伤寒杆菌菌液，出现凝集时，凝集物呈现棉絮状或云雾状，轻摇易升起和离散。

2.凝集程度

根据凝集反应的程度，分别用以下符号表示(＋＋＋＋)、(＋＋＋)、(＋＋)、(＋)、(－)。

(＋＋＋＋):管内液体澄清透明，细菌完全被凝集于管底，轻摇后可见大片的凝集块。

(＋＋＋)管内液体轻度混浊，大部分细菌凝集于管底，摇起后见凝集块小。

(＋＋)管内液体中度混浊，部分细菌被凝集于管底，凝集仍较明显，呈颗粒状或小片状。

(＋)管内液体很混浊，仅有少量细菌被凝集于管底。

(－)管内液体与对照管相同，无凝集现象。

3.效价判断:凡是在“＋＋”以上的均属于明显凝集，因此通常以出现＋＋凝集反应的最高血清稀释倍数作为血清中所含凝集抗体的效价。

例如:

　　　　　　　　　1　　　　　　2　　　　　3　　　　　　4　　　　　5　　　　　6　　　　7

最后稀释度　　　1∶40　　　　1∶80　　　1∶160　　　1∶320　　　1∶640　　1∶1280　　—

凝集程度　　　＋＋＋＋　　　＋＋＋＋　　＋＋＋　　　 ＋＋　　　　＋　　　　—　　　　—

即“＋＋”在第4管，血清最后稀释度为1∶320，即为本次实验所用血清的抗体效价。

【注意事项】

1.吸管使用:观察液面时，刻度吸管保持竖直，视线与液面凹处相平。

2.液体混合:将两种液体混合时，需用吸管连续吹吸3次。

3.液体的稀释:在血清学检验中，为使抗原和抗体间有最适比例，或为检测抗原(或抗体)的效价而常需对反应物进行连续2倍或连续10倍稀释。以连续2倍稀释为例，实验时可先在一系列试管内分别加入等量稀释液，首先在第1管内注入等量原液使原液2倍稀释，充分混匀后吸取此已经2倍稀释的混合液的半量移至第2管，然后再混合稀释、再移液……如此，原液即按2的等比级数即2¹、2²、2³、2⁴……方式连续稀释，此时原液的稀释度逐渐递增(原液浓度逐管递减)。

4.电解质:凝集反应需要适当浓度电解质参与下才出现可见凝集的现象，但电解质浓度过高会导致非特异性凝集。

5.温度:一般说来，温度升高，反应加快，但超过55℃会导致抗体破坏。应注意水浴箱中的水面勿高于试管内液面，这样有利于试管内液体的对流，增加抗原和抗体的接触。

6.酸碱度: pH值以6～8为宜。如pH值过低，接近或达到细菌抗原的等电点时，可引起非特异性的酸凝集。

【临床意义】

用以检测血清中有无某种特异性抗体及其含量(效价)，以协助临床诊断或进行流行病学调查研究。如肥达反应可诊断肠热症(伤寒和副伤寒)。

【思考题】

1.什么是效价?为什么效价可表示血清中抗体的含量?

2.肥达氏反应中要用哪几种抗原?为什么?

3.怎样分析肥达氏反应结果?

二、玻片法凝集试验

玻片法凝集试验是一种快速简便的检测方法，用已知抗体检测未知病原菌，可用于鉴定细菌，对疾病做早期诊断。

【材料】

1.沙门氏菌多价诊断血清。

2.痢疾杆菌多价血清。

3.已知的沙门氏菌培养物。

4.已知的痢疾杆菌培养物。

5.未知菌或待检病原菌如大肠杆菌培养物。

6.生理盐水、载玻片、接种环等。

【方法】

1.取清洁载玻片一张，用蜡笔画为三格，并注明号码。

2.用灭菌接种环取1∶20稀释的痢疾杆菌多价血清3～4环放于第一格，烧灼接种环，同法取沙门氏菌多价血清和生理盐水放于第二、第三格。

3.用灭菌接种环分别取待检病原菌斜面培养物、痢疾杆菌或沙门氏菌培养物少许，与玻片上的痢疾杆菌多价血清混合，烧灼接种环，同法取细菌与沙门氏菌属血清或盐水充分混合。每次加入细菌时，用接种环将细菌或盐水充分混合。

【结果】

1.轻轻摇动玻片，经1～2min后将载玻片稍微倾斜并对光观察，进行判断。

2.首先观察第三格，即生理盐水对照是否出现凝聚现象，若出现非特异性凝聚颗粒，则本次试验无效，应该重新实验。

3.若实验所用抗原为已知的痢疾杆菌，应在第一格出现凝集，为阳性;第二格血清与痢疾杆菌不对应，第三格为生理盐水，均不出现凝聚，为阴性。

4.若实验所用抗原为已知的沙门氏菌，应在第二格出现凝集，为阳性;第一格血清与第三格均不出现凝聚，为阴性。

5.若实验使用未知的病原菌培养物，则如待测菌与沙门氏菌属多价血清(第二格)不出现凝集而与痢疾杆菌(第一格)凝聚者，该菌即鉴定为痢疾杆菌;反之该菌鉴定为沙门氏菌。

【注意事项】

1.鉴定某种细菌，特别是沙门菌属或志贺菌属，原则上先用多价诊断血清检测，如为阳性，再用单价因子诊断血清进行分群或定型。

2.用接种环取一种试剂前后均需进行烧灼，不可有杂菌污染及前一试剂的残留。

3.用接种环加细菌于血清中后，应烧灼接种环方可再取细菌加入另一种血清中。

4.如受检菌液有传染性，在判定结果后及时放入消毒缸内。

【思考题】

1.简述直接凝集反应的临床意义。

2.直接凝集反应中玻片法和试管法的异同点是什么?