血液凝固及其影响因素观察

【实验目的】 观察血液凝固过程的影响因素，加深对血液凝固基本过程的理解。

【实验原理】 血液由流动状态变为不流动的胶冻状凝块的过程，称为血液凝固。血液凝固过程可分为三个阶段：凝血酶原激活物形成、凝血酶原被激活成凝血酶、纤维蛋白原转变为纤维蛋白。依启动凝血的因子不同，分为内源性凝血和外源性凝血。如果直接从血管中抽血观察血液凝固，此时因血液几乎没有组织因子参与，其凝血过程主要由内源性途径所激活，若用兔脑粉（脑组织含有丰富的组织因子）启动外源性途径，则主要反映凝血过程的第二、三阶段。若在血浆中加入外源性凝血酶，则可直接观察凝血过程的第三阶段。

血液凝固是一系列的化学酶促反应过程，受多种理化因素影响。

【实验用品】 家兔、恒温水浴器、秒表、哺乳动物手术器械1套、兔手术台、动脉夹、塑料动脉插管、清洁小试管（10×7.5mm）11支，50ml小烧杯2个、100ml烧杯1个、0.5ml吸管6支、10ml注射器、5号针头、滴管、试管架、吸管架。20％氨基甲酸乙酯、富血小板血浆、少血小板血浆、兔脑粉悬液、40mol／L的Ca Cl2溶液、生理盐水、肝素8单位（置小试管内）、草酸钾1～2mg（置小试管内）、稀释凝血酶溶液、液状石蜡、碎冰块，带橡皮刷的玻棒或竹签、棉花。

【实验步骤】

1．手术操作 由兔耳缘静脉按1g／kg体重的剂量注入20％氨基甲酸乙酯。将兔麻醉后背位固定于兔手术台上。剪去颈部兔毛，沿正中线切口约7cm，分离出一侧颈总动脉，在其下穿过两条丝线，一线将颈总动脉干头端结扎，另一线备用（供固定动脉插管）。在颈总动脉近心端向心脏方向插入动脉插管，用丝线固定。需放血时开启动脉夹即可。

2．观察纤维蛋白原在凝血过程中的作用 由颈总动脉插管放血10ml，分别注入A、B两个小烧杯内，A杯静置；B杯用带橡皮刷的玻棒或竹签不断地搅拌，取出玻棒或竹签，用水洗净，观察缠绕在玻棒或竹签上的纤维蛋白，用手触之有何感觉？经过这样处理的血液是否会发生凝固？比较A、B两个小烧杯凝血状况，分析其原因。

3．血液凝固的加速和延缓 取干净的小试管7支，按实验表2-2准备各种不同的实验条件。

实验表2-2 影响血液凝固的因素

由颈总动脉插管放血，各管加血1ml，每隔30s倾斜一次试管，若液面不随着倾斜，表示已经凝固。观察并记录各试管凝血时间，分析其原因。

如果肝素管及草酸钾管不出现血液凝固，两管各加2～3滴40mol／LCa Cl2溶液，观察血液是否会凝固？

4．观察内源性及外源性凝血过程 取干净的小试管3支，按实验表2-3分别加入富血小板血浆、少血小板血浆、生理盐水和兔脑粉悬液。然后同时加入Ca Cl2溶液，摇匀，每15s倾斜试管一次，分别记录三支试管的血浆凝固时间。血浆加钙后为什么会发生凝固？比较第一和第二管、第一和第三管的血浆凝固时间，分析产生差别的原因。

实验表2-3 内源性和外源性凝血系统的观察

注：“—”表示未加任何物品。

5．凝血酶时间的测定 取小试管1支，加入少血小板血浆0.2ml，迅速加入稀释的凝血酶溶液0.2ml，开动秒表，摇匀后置37℃水浴中。不断倾斜试管，密切观察并记录血浆凝固时间，此即“凝血酶时间”。

【注意事项】

1．第1和第2两个观察项目可同时进行，可只放血一次。

2．由动脉插管放血时，最先由插管内流出的血液应弃去。

附：试剂的配制

1．富血小板血浆和少血小板血浆的制备 取1％乙二胺四乙酸钠或0.1mmol／L枸橼酸钠抗凝全血（1份抗凝剂加9份全血）。以1000r／min的速度离心10min，取上层血浆即为富血小板血浆。取同样抗凝全血以4000r／min的速度离心10min，上层血浆即为少血小板血浆。由于血小板容易被破坏，最好在实验当天制备，不用时保存于4℃冰箱。

2兔脑粉悬液的制备

（1）兔干脑粉的制备：将新鲜兔脑彻底除去软脑膜及血管网，用生理盐水洗净，置乳钵中研碎。除去研不碎的杂质，加3倍量的丙酮，研磨0.5min（注意不要研磨太久，制成胶状，丙酮不易分离。如已成胶状，则需要加少量丙酮，轻轻混匀即可分离）。静置数分钟后，倒去上清液，再加适量丙酮，如此反复5～6次，使脑组织完全脱水呈灰白色微细粉末状。用滤纸过滤挤去丙酮，将脑粉摊开，在空气中干燥成为无黏着性的颗粒状粉末（亦可用真空抽气机或置于37℃温箱中1h使其干燥）。干脑粉制成后应分装密封，保存于普通冰箱4℃内，半年之内活性不变。

（2）兔脑悬液的制备：取干脑粉0.3g放入大试管内，加生理盐水5ml，混匀，置45℃水浴内10min，并经常摇动。然后以1000r／min的速度离心1min（或静置），将大颗粒沉淀弃去，取上层乳白色液体即为脑悬液。应用前应先检查其活性：取血浆0.1ml、脑悬液0.1ml，加40mol／LCa Cl2溶液1ml，观察其凝固时间，如凝固时间在12～14s内，即可采用；否则应调整其浓度（为使学生实验容易掌握时间，本实验所要求的脑悬液活性是使血浆凝固时间为1min左右）。脑悬液置普通冰箱保存2周内其活性恒定。

3．凝血酶溶液的制备

（1）浓缩凝血酶溶液的制备：取枸橼酸钠抗凝血浆100ml，加冷蒸馏水1000ml，保持0～5℃ ，边搅拌边缓慢加入2％醋酸，调节pH至5.3（约需3.2ml）。此时产生白色混浊，置冰箱过夜。离心后弃其上清液，沉淀物用25ml生理盐水溶解，用2％Na2CO3溶液调节pH至7.0（约需2滴，碱过量时可用醋酸纠正），再加0.25mol／LCa Cl2溶液3ml，立即用玻棒搅拌，以除去不断生成的纤维蛋白丝。待2h让凝血酶充分形成，即得粗制的凝血酶溶液。若加入等量丙酮，离心后弃去上清液，所得沉淀用生理盐水25ml溶解，10min后离心，收集上清液，即为精制凝血酶溶液，分装保存于－20℃ 。

（2）稀释凝血酶溶液的制各：以生理盐水将上述浓凝血酶溶液稀释，使该稀释液0.1ml能将0.1ml正常血浆在16～18s内凝固为度。

【临床意义】

1．临床工作中，有时需要对血液凝固过程加以控制，以加速、延缓或阻止血液凝固。如：外科手术时，加速切口血液凝固可尽快止血。在血液检验和输血过程中，需要延缓或阻止血液的凝固。

2．凝血酶时间是反映血浆内纤维蛋白原水平及血浆中肝素样物质的多少。前者增多和后者减少时凝血酶时间缩短，否则延长。凝血酶时间可用于肝素用量的检测。