标记酶的选择

标记酶的种类会直接决定分析方法的专属性、灵敏度、准确性，因此酶的选择显得尤为重要。标记酶一般具备以下主要特征:①特异性强，酶分子应能与特定药物相结合;②活性强，在低浓度下就有较高的催化率;③测定方法简便易行、酶和底物均价廉易得;④稳定性良好，酶活性不易受底物或者其他反应条件的影响。

传统常见标记酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶等。辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。该酶是以糖蛋白为辅酶，以亚铁血红素为辅基的复合酶，是ELISA中应用最广泛的标记用酶。HRP酶蛋白和其他杂蛋白的最大吸收光谱为275 nm，辅基部分的最大吸收光谱为403 nm。

HRP催化的反应式为:

DH2+H2O2 D+2H2O

上述反应式中，DH2为供氢体，H2 O2为受氢体，其中HRP对受氢体的专一性非常高。HRP作用的底物有多种，常见的有以下几种:

(1)邻苯二胺(OPD):OPD反应后呈现橘黄色，加硫酸终止反应后呈现棕黄色，产物不稳定，且有致癌性，最大吸收峰为492 nm。

(2)四甲基联苯胺(TMB):反应后呈蓝色，加酸终止反应后变成黄色，产物稳定，且无致癌性，是ELISA中最常用的底物，最大吸收峰为450 nm。

(3)3，5－氨基水杨酸(5－ASA):与酶反应后显棕色，用NaN3或者NaOH终止反应，最大吸收峰为449 nm。

(4)2，2’－氨基－二(3－乙基－苯并噻唑啉磺酸－6)铵盐(ABTS):反应后显蓝绿色，最大吸收峰为642 nm。

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)是从小牛肠黏膜或大肠杆菌中提取的一种磷酸酯酶，其作用是催化磷酸酯水解释放出无机磷酸而显色，或通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，然后在还原剂作用下生成蓝色的产物进行测定。其作用底物主要有:

(1)1，4－硝基酚磷酸盐(p－nitrophenyl phosphate，PNP):反应后显黄色，以NaOH终止反应，最大吸收波长在400 nm左右。

(2)萘酚－AS－Mx磷酸盐(Naphthol AS－Mx phosphate)+重氮盐:反应后显红色，最大吸收波长为500 nm。

(3)4－甲基－伞酮基磷酸盐(4－methyl－β－umbelliferyl phosphate，4－MUP):以360 nm为激发光，可以发射450 nm荧光。

β－半乳糖苷酶(β－galactosidase，β－Gal):β－Gal源于大肠埃希菌，多用于均相酶免疫反应。其作用原理是与其底物作用后生成高强度荧光物质后，用荧光计测量。β－Gal常见的底物有:

(1)邻硝基苯－β－D－半乳糖吡喃苷(o－nitrophenyl－βgalactopyanoside，O－NPG):O－NPG法以NaHCO3终止反应，反应物最大吸收峰405 nm

(2)氯酚红－β－D－半乳糖吡喃苷(chlorophenolic red－β－D－galactopyranoside，CPRG):CPRG法同样以NaHCO3终止反应，反应物最大吸收峰为570 nm处。

除上述介绍的标记酶外，商品试剂中常见的还有葡萄糖氧化酶、苹果酸脱氢酶、脲酶、6－磷酸葡萄糖脱氢酶、青霉素酶等，各自作用的底物也有所不同，这里不再作详细介绍。