酶的专一性及影响酶活性的因素

酶的专一性及影响酶活性的因素_生物化学实验技术

实验项目十　酶的专一性及影响酶活性的因素

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述影响酶活性各个因素的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述影响酶活性因素的实验操作要点。

（3）能够准确鉴别不同条件对酶活性的影响，并能说明其意义。

【能力目标】

（1）能够正确完成测定各因素对酶活性影响的各项操作，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够正确采集唾液，并知道有哪些注意事项。

（3）能够正确分析各个因素对酶活性的影响。

案例引导

酶作为生物催化剂，在人体体内起着重要的作用，体内诸多的生物化学反应，都是由酶催化反应完成的。各种物质的代谢，如糖类的代谢、脂类的代谢及蛋白质的代谢，都是在酶的作用下进行分解代谢的。人的正常体温在37℃左右，超过这个温度称为发烧。如果长时间的发烧，会对身体有很大的损害。结合所学知识，思考人体体温升高，身体会产生什么样的影响。

（提示：温度对酶活性有影响）

【实验原理】

一、温度、pH值、激活剂、抑制剂对酶活性的影响

酶的催化活性受温度、pH值及某些物质的影响显著。酶反应在低温的时候进行较慢，随着温度的升高反应速度加快，当达到最适反应温度的时候其活性最高，之后，随着温度的升高反应变得缓慢，直至完全停止。

酶活性与溶液的pH值有关。pH值既影响酶蛋白本身构象，也影响底物的解离程度，从而改变酶与底物的结合和催化作用。故每种酶都有其自身最适pH值的作用环境。过酸、过碱均可引起酶蛋白变性而降低或失去活性。唾液淀粉酶的最适pH值为6.8，氯离子对该酶的活性有激动作用，铜离子则有抑制作用。

淀粉在淀粉酶催化下水解，其最终产物是麦芽糖。在水解反应过程中淀粉的相对分子质量逐渐变小，形成若干相对分子质量不等的过渡性产物，称为糊精。向反应系统中加入碘液可检查淀粉的水解程度，淀粉遇碘呈蓝色，麦芽糖对碘不显色。糊精中相对分子质量较大者遇碘呈蓝紫色，随糊精的继续水解，遇碘呈橙红色。

根据颜色反应，可以了解淀粉被水解的程度。在不同温度、不同酸碱度下，唾液淀粉酶活性不同，淀粉水解程度也不一样。另外，激活剂、抑制剂也能影响淀粉的水解。因此，通过与碘反应的颜色判断淀粉被水解的程度，进而了解温度、pH值、激活剂和抑制剂对酶促反应的影响。

二、酶的专一性

唾液淀粉酶可将淀粉水解成麦芽糖及少量葡萄糖，二者均属于还原性糖，能使班氏试剂中的二价铜离子还原成一价铜离子，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。而蔗糖不能被此种酶水解，也不具有还原性，故不能与班氏试剂发生颜色反应。

【实验器材】

10mm×100mm试管，试管架，恒温水浴箱，沸水浴，冰浴，试管夹，滴管，蜡笔，漏斗，烧杯。

【药品及试剂】

1%淀粉溶液，稀释唾液，pH值为6.8的缓冲液，pH值为3.0的缓冲液，pH值为8.0的缓冲液，1%蔗糖溶液，1%NaCl溶液，1%CuSO₄溶液，1%Na₂SO₄溶液，稀碘溶液。

【试剂配制】

1.1%淀粉溶液

取可溶性淀粉1g，加入5mL蒸馏水，调成糊状，再加80mL蒸馏水，加热并不断搅拌，使其充分溶解，放冷，最后用蒸馏水稀释至100mL。

2.稀释唾液的制备

将痰咳尽，用水漱口（去除食物残渣、洗涤口腔），含蒸馏水约30mL，做咀嚼运动，2min后吐入烧杯中备用（不同人甚至同一人在不同时间所采集的唾液中淀粉酶的活性均不一样，结果会有差别，若想得到满意结果，应事先确定稀释倍数）。

3.pH值为6.8的缓冲液

取0.2mol/L Na₂HPO₄溶液772mL，0.1mol/L柠檬酸溶液228mL，混合后即成。

4.pH值为3.0的缓冲液

取0.2mol/L Na₂HPO₄溶液205mL，0.1mol/L柠檬酸溶液795mL，混合后即成。

5.pH值为8.0的缓冲液

取0.2mol/L Na₂HPO₄溶液972mL，0.1mol/L柠檬酸溶液28mL，混合后即成。

6.稀碘溶液

取碘2g，碘化钾4g，溶于1000mL蒸馏水中，储存于棕色瓶中。

7.1%CuSO₄溶液

取CuSO₄·5H2O 15.625g，溶于1000mL蒸馏水中。

8.1%NaCl溶液

取NaCl 1g，溶解后加蒸馏水至100mL。

9.1%Na₂SO₄溶液

取Na₂SO₄1g，溶解后加蒸馏水至100mL。

10.1%蔗糖溶液

取蔗糖1g，溶解后加蒸馏水至100mL。

11.班氏试剂

（1）甲液：取17.3g结晶硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）置于100mL蒸馏水中，加热溶解。冷却后稀释至150mL。

（2）乙液：取173g柠檬酸钠和无水碳酸钠100g置于600mL蒸馏水中，加热溶解。冷却后稀释至800mL。

将甲液慢慢倒入乙液中，并加水至1000mL，混匀，此试剂可长期保存。

操作流程

【操作步骤】

1.温度对酶促反应的影响

（1）取3支试管，编号，每管中各加入pH值为6.8的缓冲液15滴，1%淀粉5滴。

（2）将第一管放入37℃恒温水浴箱中，第二管放入沸水浴中，第三管放入冰浴中。

（3）各管放置5min后，分别加稀释唾液5滴，再放回原处。

（4）放置10min后取出，分别向各管内加入稀碘溶液1滴，观察3管中颜色的区别，说明温度对酶促反应的影响。

2.pH值对酶促反应的影响

（1）取3支试管，编号。按表3－23加入试剂。

表3－23　pH值对酶活性的影响（单位：滴）

（2）将1、2、3号管摇匀放入37℃恒温水浴箱中保温。

（3）5～10min后，取出分别加入1滴稀碘溶液，观察3管颜色的区别，说明pH值对酶促反应的影响。

3.激活剂与抑制剂对酶促反应的影响

（1）取4支试管，编号按下表（表3－24）加入试剂。

表3－24　激活剂与抑制剂对酶活性的影响（单位：滴）

（2）摇匀1、2、3、4号管后放入37℃恒温水浴箱中保温。

（3）5～10min后，取出各管分别加入稀碘溶液1滴，观察各管颜色，说明激活剂与抑制剂对酶促反应的影响。

讨论该实验设计第四管是何目的？该管应与哪支管颜色相同？

4.酶的专一性

（1）取试管3支，标号，按表3－25进行操作。

表3－25　酶的专一性（单位：滴）

（2）各管混匀后，置于37℃恒温水浴箱中保温5～10min，分别加班氏试剂20滴。

（3）各管混匀后置于沸水浴中煮沸8～10min，观察结果并记录。

讨论：以唾液淀粉酶为例，解释“酶的绝对专一性”。

【实验数据处理及结果分析】

根据不同的温度、pH值及激活剂与抑制剂对酶活性影响的不同，相应的溶液会产生不同的颜色变化。

【注意事项】

（1）注意实验器材的干净，避免杂质影响反应结果。

（2）各管反应时间应严格控制，保证一致。

【实验意义】

人体是一个复杂的生物反应器，代谢反应有数千种之多。为保持人体健康，酶必须准确地调节各个反应，以维持身体内物质和能量的平衡。当身体内因缺乏某种酶或某些酶的活性而受影响时，代谢反应即会受到影响，从而导致疾病的发生。随着对疾病发生机制的深入研究和了解，医药中酶的应用越来越广泛。因此，对影响酶活性因素的研究，在人体疾病发生机制及其治疗方面都有重要意义。

能力检测

一、单项选择题

1.下列叙述错误的是（　　）。

A.酶活性最高时的温度称为酶的最适温度

B.最适温度是酶的一个特征常数

C.使酶活性最高时的pH值称为酶的最适pH值

D.增加底物浓度可解除竞争性抑制

E.竞争性抑制作用的强弱取决于抑制剂浓度与底物浓度的相对比例

2.下列关于pH值对酶促反应速度的影响错误的是（　　）。

A.pH值的改变影响酶的活性中心的形成

B.pH值的改变影响酶与底物复合物的生成

C.pH值的改变影响底物的解离

D.pH值影响酶的活力

E.以上都不是

3.下列关于竞争性抑制剂叙述错误的是（　　）。

A.结构与底物相似　　　B.与酶的活性中心结合

C.结合力为非共价键　　D.与酶的结合是可逆的

E.抑制程度仅与抑制剂浓度有关