细胞色素相关技术

药物进入生物体内后与机体间发生一系列的相互作用而使化学结构产生变化，一些药物经代谢失去药理活性，随尿和粪便排出体外，也有一些药物通过代谢产生了有药理活性或毒性的代谢物。以肝脏为基础的体外代谢肝脏富含参与药物代谢的混合功能氧化酶系统，是机体进行生物转化的主要场所。其中细胞色素P450酶参与的氧化代谢是药物消除的主要途径，目前有多种围绕该酶药物转化研究方法。

（一）肝微粒体和肝细胞体外代谢法

肝微粒体体外代谢法，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行的药物代谢研究体系。肝细胞体外代谢法与肝微粒体体外代谢法相似，是由制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。这两种方法可通过测定药物在体外条件下代谢量获得酶促动力学参数及米氏常数，并运用合理的药动学模型来推断体内药物的代谢清除过程。将药物加入肝微粒体或肝细胞系统中进行孵育后，利用质谱检测离子碎片来鉴定代谢物的结构，包括药物不同位点上的羟化物或去烷基产物，从而确定代谢途径。

某些药物在体内不同程度地诱导或抑制肝药酶活性，这将影响到同时服用的其他药物的代谢。若与其他经这一家族酶代谢的药物同时服用，则可能增强或减慢其代谢，从而减弱或强药效，甚至产生毒副反应。将候选药物与肝微粒体或肝细胞体系统共同孵育后测定代谢酶活性，考察药物对代谢酶活性的作用，能够推测与其可能发生相互作用的药物。

药物的体内处置过程普遍存在性别差异。1995—2000年，FDA批准的300个新药中有163个药物的药动学存在性别差异，其中11个药物的性别差异＞40%。细胞色素P450酶介导的药物代谢过程的差异被认为是引起药动学性别差异的主要因素。P450酶的活性和种类具有明显的种属差异，如CYP3A4是人体中含量最丰富的P450酶，它的活性在人体有明显性别差异。但是在大鼠体内该酶并不存在，因此动物体内P450酶活性的性别差异不能等同于人P450酶活性的性别差异。而通过临床药动学的试验结果判断酶活性的性别差异存在很多干扰因素。这些因素的差异会影响药物药动学特征。比如阿普唑仑、依托泊苷和克林霉素虽然是CYP3A4的底物，但其清除率并没有显示出显著性别差异。因此，临床药代数据显示的性别差异需要体外试验的支持。随着体外试验技术的发展逐步采用体外肝微粒体或肝细胞孵育CYP3A4的特异性底物，测定代谢产物的量，考察肝CYP3A4酶的活性。大部分体外肝微粒体与肝细胞体外代谢试验能准确地模拟药物在体内的转化过程。通过肝微粒体和肝细胞体外代谢评价肝CYP3A4酶的活性，避免了体内试验中吸收、分布和消除对药物处置的影响，提高了评价CYP3A4活性性别差异的准确性。

肝微粒体体外代谢法制备简单，代谢过程快，结果重现性好。同时，该方法可用于体外代谢清除等方面的研究。但肝微粒体体外代谢法与体内情况的一致性方面存在一定差异。与肝微粒体孵育体系相比，肝细胞孵育体系保留了细胞的完整性，更接近于体内的真实环境，能准确地模拟药物在体内的转化过程。但肝细胞制备技术较复杂，由于在新鲜分离的肝细胞中，介导药物代谢的细胞色素P450酶系存在时间依赖性衰减的现象，所以一般的肝细胞培养都要求在肝细胞生存时间跨度内进行。

（二）细胞色素P450重组酶技术

细胞色素P450重组酶即利用基因工程及细胞工程技术，将酶基因整合到大肠埃希菌或昆虫细胞，经细胞培养，表达高水平的细胞色素P450酶系，纯化后可获得较纯的单一细胞色素P450同工酶。细胞色素P450重组酶系在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，可为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。在明确某些药物经特定酶代谢后，即以此酶进行单一代谢，更准确地观察代谢结果，避免受其他酶共同参与此代谢途径的干扰。虽然细胞色素P450重组酶技术具有先进性，但由于受到设备条件和技术的限制，通过基因工程获得的酶量与种类有限，酶纯化程度也有待进一步提高。