细胞免疫相关指标测定

一、细胞分离技术

(一)白细胞的分离方法

【概述】白细胞包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞三类,具有吞噬异物并产生抗体,治愈机体损伤,抗御病原体入侵,对疾病的免疫抵抗力等作用。

【检测方法】

1.自然沉降法　人外周血红细胞与白细胞的比例为(6000～10 000)∶1,两类细胞的沉降速度不同,据此加以分离。自然沉降法是利用红细胞自然沉降率较快加以分离。该法简便易行,对细胞损伤少,但纯度差。

2.聚合物加速沉降法　利用高分子量的聚合物促使红细胞凝聚成串钱状,从而加速红细胞沉降,使之与白细胞分离。常用的高分子聚合物有明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及甲基纤维素等。

【参考区间】白细胞为(4.0～10.0)×109/L。

【临床意义】白细胞的分离,有助于对其进行功能和数量测定,是观察机体免疫状态的一种重要手段。

(二)外周血单个核细胞的分离方法

【概述】外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞。单个核细胞的比重与外周血其他细胞不同,红细胞和多核细胞的比重在1.092左右,较单个核细胞的比重(1.075～1.090)大。因此利用分层液(比重在1.075～1.090)可使不同类别的血细胞按其相应比重分布,从而被分离。

【检测方法】

1.Ficoll分层液法(聚蔗糖-泛影葡胺分层液法)　是一种单次密度梯度离心分离法,其分布由上到下依次为:稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。

2.Percoll分层液法(聚乙烯吡咯烷酮分层液法)　是一种连续密度梯度离心分离法,其分布由上至下依次为:死细胞层和血小板、富含单核细胞组分层(75%)、富含淋巴细胞的组分层(98%)、红细胞与粒细胞组分层。该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一个较好的方法,但操作流程较长,手续较多。

【参考区间】每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞。

【临床意义】外周血单个核细胞即外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞和单核细胞,是免疫学试验中最常用的细胞群,其分离纯化有助于免疫学试验的有效进行。

(三)淋巴细胞的分离方法

【概述】细胞分离是进行有关细胞免疫方面的检测十分重要的技术,特别是有关免疫细胞功能的体外实验,往往须将待检淋巴细胞从血液或组织中分离出来。根据密度离心分离原理得到的淋巴细胞主要是在单个核细胞(PBMC)中,由于淋巴细胞在数量是占单个核细胞的大多数,因此,单个核细胞有时也可以大致地代表淋巴细胞直接用于实验,但严格地讲,从单个核细胞中去除单核细胞才能较为准确地代表淋巴细胞。

【检测方法】贴壁黏附法、吸附柱过滤法、磁铁吸引法、Percoll分离液法。

【临床意义】将淋巴细胞从单个核细胞中分离出来,有助于其亚群的分离及表面标志的检测。

二、淋巴细胞亚群的测定

【概述】淋巴细胞是复杂不均一的细胞群体,它包含了许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。循环血液中淋巴细胞主要包括T细胞、B细胞和NK细胞。目前,检测T、B和NK细胞最简便的方法是用免疫学技术测定它们的表面标志物。例如,T细胞主要测定细胞膜上的分化抗原群:CD3、CD4、CD8,CD3为所有T细胞的特有标志,CD4是辅助T细胞的标志,CD8是细胞毒T细胞或抑制性T细胞的标志。B细胞的表面物质主要是膜免疫球蛋白或表面免疫球蛋白Ig M和Ig D以及CD抗原CD19、CD20、CD22。NK细胞的特异表面标志主要为CD56和CD16。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法;而选择性去除不要的细胞,仅留下所需的细胞是为阴性选择法。

1.CD2分子　表达于全部人T细胞以及NK细胞表面。人T细胞表面的CD2分子即为绵羊红细胞受体(erythrocyte receptor,ER),在一定的体外实验条件下,绵羊红细胞可与T细胞CD2分子结合,形成玫瑰花,称E花环形成试验(rosette formation test),为一种细胞免疫功能的检测方法。

2.CD3分子　CD3分子表达在人全部T细胞上,是鉴定T细胞的重要标记。CD3分子是由γ、δ、ε和η等几种多肽链组成,并与T细胞识别抗原受体形成TCR/CD3复合物;其中TCR特异性识别抗原,而TCR与抗原结合后所产生的活化信号是由CD3分子传递到T细胞内部。

3.CD4分子　CD4分子分布在T细胞的辅助细胞诱导亚群和抑制细胞诱导亚群(helper inducer/suppressor inducer)表面,在T细胞亚群的鉴别中具有重要意义。CD4分子在胞膜外有4个结构域,其中第一结构域是人类免疫缺陷病毒(HIV)外壳蛋白gp120识别的部位,因此CD4分子是引起人类艾滋病HIV的受体。由于CD4阳性T细胞具有重要的免疫功能,HIV感染CD4阳性T细胞后细胞数量明显减少,功能降低,是发生获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的主要原因。CD4分子可与抗原提呈细胞表面的MHCⅡ类抗原非多态部分相结合,协助Th细胞识别APC细胞表面外来抗原与MHCⅡ类抗原的复合物。

4.CD8分子　由α、β两条链组成,常用的CD8单克隆抗体如OKT8、Leu2等是识别CD8分子的α链。CD8分子分布在抑制性T淋巴细胞(suppressor T lymphocyte,Ts)和杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL或Tc)表面,在鉴别T细胞亚群中有重要作用。CD8分子可与MHCⅠ类抗原非多态部分相结合。Tc杀伤病毒感染靶细胞时,Tc必须同时识别外来抗原(如病毒抗原)和靶细胞上MHCⅠ类抗原的复合物。

5.主要组织相容性复合体抗原(MHC)　T细胞胞膜上表达的MHC抗原为Ⅰ类和Ⅱ类抗原,其中MHCⅠ类抗原表达在所有发育阶段的T细胞表面,静止T细胞无MHCⅡ类抗原,但T细胞活化后即可表达。

6.CTL-4和CD28　CTL-4的结构和CD28分子高度同源,是由两条多肽链通过二硫键相连而成的同源二聚体。CTL-4和CD28的天然配体为CD80和CD86。CD80/CD86分子主要表达于APC表面,活化T细胞表达CTL-4和CD28,在抗原诱导的T细胞活化中,CD80/CD86与CD28结合,为T细胞提供主要的协同刺激信号,CD80/CD86与CTL-4结合,给予已活化T细胞抑制信号。

7.CD40L　属Ⅱ型跨膜蛋白,主要表达于活化的CD4+和CD8+T细胞表面。CD40L与B细胞表面的CD40相互作用后,作用协同刺激信号参与促进B细胞增殖、分化、抗体合成和TD-Ag诱发的免疫应答反应。

【检测方法】流式细胞术、免疫荧光法、AP-AAP桥联酶免疫法等。

【参考区间】检测方法不同参考值各异。各实验室应建立自己实验室的参考值。中国人群的淋巴细胞亚群参考值尚无统一定论,可暂时参考试剂盒说明书。

免疫荧光法:CD3+细胞71.5%±6.2%或65%～80%,CD3+CD4+45.7%±5.30%,CD3+CD8+27.9%±5.0%,CD4+/CD8+1.66±0.33,NK细胞5%～7%,B细胞16%～28%或8%～15%。

流式细胞术:CD3+为61%～85%,CD4+为28%～58%,CD8+为19%～48%,CD4+/CD8+为(0.9～2.0)/1。

【临床意义】淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标,它总体反映机体当前的免疫功能、状态和平衡水平,并可以辅助诊断某些疾病,如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等,对分析发病机制、观察疗效及判断预后有重要意义。在自身免疫性疾病(如活动性系统性红斑狼疮)中,T抑制/细胞毒细胞(CD8+)的数量的功能低下是发病的重要因素,有时也有T辅助/诱导细胞(CD4+)数量和功能的增高;在乙型肝炎、自身溶血性贫血、类风湿症、重症肌无力等患者都具有类似的T亚群异常的特征。CD4+/CD8+比值减少是免疫缺陷病的重要特征,在AIDS(艾滋病)患者中就存在着CD4+细胞显著减少的现象;在一些上呼吸道感染的患者中CD8+细胞的数量和功能都有异常增高的现象。很多感染性疾病(如水痘、猩红热、麻疹患者)都和免疫抑制有关,CD4+/CD8+比值的倒置被认为是病毒感染性疾病的重要特征。

在肿瘤患者外周血中T淋巴细胞亚群数值都有异常,其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少,而CD8+细胞明显增加,CD4+/CD8+比值显著降低,说明肿瘤患者的细胞免疫功能处于免疫抑制状态,患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降,形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中,患者外周血CD4+细胞数减少,CD8+细胞数增多,CD4+/CD8+比值明显下降。因此T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生发展、了解发病机制、指导临床治疗都有极其重要的理论意义和临床价值,成为临床检验的一项重要指标。

CD3降低见于自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。CD4降低见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者。CD8减低见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病。CD4/CD8比值增高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒性感染、变态反应等。CD4/CD8比值减低见于艾滋病(常<0.5)。监测器官移植排斥反应时CD4/CD8比值增高,预示可能发生排斥反应。CD3、CD4、CD8较高且有CD1、CD2、CD5、CD7增高,则可能为T细胞型急性淋巴细胞白血病。

三、T细胞功能检测

单独测定淋巴细胞或其亚群数量,常常不能反映淋巴细胞功能。淋巴细胞功能实验则是检查淋巴细胞或某些亚群在特定抗原刺激作用下分泌某些细胞因子或抗体的能力,可分为体内试验和体外试验。体内试验主要是进行迟发型超敏反应,间接反映T细胞的功能状况;体外试验主要包括淋巴细胞的增殖试验、细胞毒试验以及激活的淋巴细胞分泌细胞因子能力的测定。

(一)T细胞增殖功能测定

【概述】T淋巴细胞在体外培养过程中,经特异性抗原和非特异性抗原(PHA或Con A)的共同刺激,淋巴细胞DNA合成分裂增殖,产生一系列变化,比如细胞体积增大、胞质增多、出现空泡、核仁明显。核染色质疏松、细胞代谢旺盛并转化为淋巴母细胞即淋巴细胞转化现象等。研究表明,特异性抗原和非特异性有丝分裂原刺激的信号转导通路相同,故检测淋巴细胞转化试验可作为测定机体免疫功能的指标之一。

【检测方法】

1.形态学检查法　转化率=转化的淋巴细胞数/(转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数)×100%。

2.3H-Td　R掺入法 通常以刺激指数(SI)表示转化能力。SI=刺激管cpm/对照管cpm。

3.MTT比色法　以刺激指数(SI)表示转化能力。SI=试验孔OD均值/对照孔均值。

【参考区间】正常人T细胞转化率为60%～80%。

【临床意义】

1.T淋巴细胞受特异性抗原或非特异性刺激后,发生母细胞转化,DNA合成增加。可由此了解T细胞的应答功能,这反映出受试者T细胞总体水平的应答功能,判断细胞免疫状态和探讨发病机制。

(1)转化率增高:只有Down综合征患者外周血淋巴细胞对PHA刺激较正常人敏感,微量PHA即可使本病患者T细胞发生转化。

(2)转化率降低:细胞免疫缺陷或功能低下者,其转化率可明显低于正常,如运动失调性毛细血管扩张症,本病由于胸腺发育不良,细胞免疫能力低下,OT反应阴性。此外,如各种恶性肿瘤、霍奇金病、淋巴瘤、淋巴肉芽肿等疾病时均可低于正常值。

2.估计疾病的疗效和预后。恶性肿瘤或慢性白色念珠菌病,经转移因子或免疫增强剂治疗后,其转化率可由治疗前的低值转变为正常,反之则预后不良。

3.寻找迟发型变态反应的原因。在临床上常由于服用某种药物而发生迟发型变态反应疾病,为了寻找病因,可将患者外周血淋巴细胞与可疑药物共同培养,若转化率高于对照药物,即可判明病因。

4.选择适宜的移植供体,采用混合淋巴细胞培养。

(二)T细胞分泌功能测定

T细胞分泌各类细胞因子和生物活性,测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后所分泌的各种细胞因子,可以反映T细胞功能。

(三)T细胞介导的细胞毒试验

【概述】T细胞介导的细胞毒作用是指激活的细胞毒性T细胞对带有特异性抗原的细胞或相应的靶细胞的直接杀伤作用。这种效应在抗病毒感染、同种异体移植排斥反应和抗肿瘤免疫中起重要作用。

【检测方法】形态学检查法、51 Cr释放法、细胞增殖评价法。

【临床意义】T细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T细胞的特性,凡致敏T细胞再次遇到相应靶细胞抗原,可表现出破坏和溶解靶细胞,它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。该试验原理是选用适当的靶细胞(常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株),经培养后制成一定浓度的细胞悬液,按一定比例与待检的淋巴细胞混合,共温育一定时间,观察肿瘤细胞杀伤的情况。

四、B细胞功能检测

B细胞主要产生Ig参与机体体液免疫应答,B细胞功能低下或缺乏者对外源性抗原刺激的应答能力减弱或缺陷,特异性抗体产生减少或缺如。因此。B细胞功能试验方法有血清Ig含量测定和产生抗体能力检测等。

(一)溶血空斑试验

【概述】溶血空斑试验(plaque forming cell assay,PFC)是体外检测B淋巴细胞抗体形成功能的一种方法。其原理是将绵羊红细胞免疫的家兔或小鼠,取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液,与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中,其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞,在周围形成一个可见的空斑,一个空斑代表一个抗体形成细胞,空斑的数量反映机体的体液免疫功能。

【检测方法】经典溶血斑形成试验、被动溶血空斑形成试验。

【临床意义】溶血空斑形成试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响,评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

【注意事项】该方法不够灵敏。另外,许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难,使该方法应用受到限制。

(二)酶联免疫斑点试验

【概述】酶联免疫斑点(ELISPOT)是基于ELISA试验发展起来的,既可从单细胞水平检测抗体分泌细胞,又可以检测抗体分泌量的一种细胞免疫学检测技术。ELISPOT也是检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法。

【检测方法】ELISPOT的技术原理与ELISA基本相似,即通过生物酶高催化效率放大反应效果,进而达到很高的敏感性,便于检测微量的抗原或抗体。其实验设计是在96微孔培养板的底部披覆PVDF薄膜,包被经特殊挑选的、无毒性(不含叠氮化钠、内毒素)的单克隆抗体。然后洗脱未结合的单克隆抗体,封闭。随后将经适当分离处理后的细胞(如外周血单核细胞PBMC)分配到微孔上,用适当的抗原刺激,并将96孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般情况下,记忆型T细胞在受抗原刺激后数小时开始分泌细胞因子(cytokine,CK),此时局部(紧靠分泌细胞的周围)分泌出的CK会被PVDF薄膜上包被的特异性抗体捕获。洗去微孔中的细胞和未结合的组分之后,被捕获的CK进一步使用生物素标记的特异性检测抗体来标志。然后将未结合的酶洗除,再以AKP或HRP标记的链亲和素与之作用,并加入底物(如BCIP/NBT)使其呈色,有反应作用的细胞会留下大小染色的斑点。斑点多少可以在ELISPOT读数系统上进行自动化计数或在立体显微镜上进行人工计数。

【临床意义】

1.侧重于细胞检测,弥补了体液中CK半衰期短的不足,当体液中某CK含量较低时,用ELISPOT法检测具有较高灵敏性。

2.既可检测自发分泌细胞,又可检测抗原特异性CK分泌细胞,具有较高特异性,并可观察药物的治疗反应,且首次使对CSF中T、B细胞研究成为可能,对神经免疫疾病发病机制研究及临床疗效观察均有重要价值。

3.因新鲜标本来源的限制,冻存的外周血或CSF单个核细胞的分泌功能与新鲜标本差异无显著性,既可减少试剂浪费,又可利于临床做回顾性或前瞻性研究。

【注意事项】

1.目前,ELISPOT法在全球尚未完全标准化,必须采用最佳匹配(best pair)的包被抗体和检测抗体、ELISPOT板、形成斑点的底物及其显色时间等。

2.比ELISA技术复杂而费时,需严密控制实验条件,操作人员需技术熟练,并能对实验结果进行分析,以减少实验偏差。

3.属半定量方法,当细胞产生大量CK时,不宜选用ELISPOT,而可选用ELISA。

(三)B细胞表面膜免疫球蛋白的检测

【概述】B细胞表面膜免疫球蛋白(SmIg)又称BCR,表达于所有成熟的B细胞和大多数B细胞瘤的细胞表面,属于免疫球蛋白超家族原型,是B细胞最具特性的表面标志。SmIg的主要作用是结合特异性抗原,故又称抗原受体。成熟B细胞的SmIg主要为mIg M和mIgD。

【检测方法】大多数采用荧光素或酶标记的抗人Ig抗体通过直接荧光免疫法或酶免疫组织化学法检测SmIg。正常人外周血中SmIg细胞一般为8%～12%。

【参考区间】总SmIg 8.0%～24%,SmIgG 0～15%,SmIg M 0.6%～8.2%,SmIgD 0.2%～10.2%。

【临床意义】B淋巴细胞表面有膜免疫球蛋白,而T淋巴细胞表面无膜免疫球蛋白,因此该实验主要用于检测外周血B淋巴细胞的百分率,有助于免疫缺陷病、淋巴细胞增生性疾病的病因诊断及疗效观察,还可判断B细胞的发育程度。升高可见于慢性淋巴细胞白血病、巨球蛋白血症,降低可见于原发性免疫缺陷病、恶性肿瘤。

五、NK细胞功能测定

【概述】NK细胞即天然杀伤细胞(natural killer,简称NK细胞),具有细胞介导的细胞毒作用,对肿瘤细胞、病原体感染细胞有直接杀伤作用。目前国内外多采用检测NK细胞活性来研究不同疾病状态下NK细胞的杀伤功能,可以较大程度地了解机体的细胞免疫功能,因为它与多种疾病的发生、发展及治疗转归密切相关。

【检测方法】形态学法、酶释放法、51 Cr释放法、化学发光法、流式细胞术法等。

【参考区间】51 Cr释放法0.28～0.52。各实验室建立自己实验室的参考值。

【临床意义】NK细胞不需MHC参与,亦不需抗原致敏或抗体辅助,即可直接杀伤肿瘤细胞或溶解被病毒和胞内寄生菌感染的细胞,在机体免疫监视、抗肿瘤和早期抗感染过程中起重要作用。NK细胞测定可反映机体免疫功能状况。

1.NK细胞活性降低　恶性肿瘤患者、再生障碍性贫血和白血病前期、酒精性肝硬化、慢性肝炎、AIDS和使用免疫抑制剂的患者外周血中NK细胞活性都可降低,它反映了患者机体免疫应答功能的受损程度,还有助于观察治疗的效果及预后判断。妊娠期间NK细胞活性也可下降。

2.NK细胞活性升高　在病毒感染早期、Down综合征、器官或骨髓移植受者,以及免疫增强剂治疗的患者可出现NK活性升高。

六、嗜中性粒细胞免疫功能测定

(一)嗜中性粒细胞趋化功能测定

【概述】嗜中性粒细胞在趋化因子如微生物的细胞成分及其代谢产物、补体活性片段C5a、某些细胞因子等作用下产生趋化运动,其趋化运动强度可反映中性粒细胞的趋化功能。

【检测方法】滤膜渗透法、琼脂糖平板法。

【参考区间】趋化移动指数为0.0316±0.0059。

【临床意义】在免疫反应,特别是炎症反应时,趋化因子的量升高,细胞的趋化移动加快。病毒感染,尤其在早期,常在正常范围内,而细菌感染时迅速升高,可以此鉴别细菌或病毒感染。嗜中性粒细胞趋化功能缺陷见于迟钝白细胞综合征、膜糖蛋白缺陷症、糖尿病、新生儿、烧伤、幼年型牙周病等。

【注意事项】为使试验结果有较好的可重复性,正试验前应通过预试验选择最适白细胞浓度和趋化因子浓度。在测试结果时,应注意固定采用一种计数方法。

(二)嗜中性粒细胞吞噬和杀菌功能测定

【概述】嗜中性粒细胞可吞噬颗粒性物质(如金黄色葡萄球菌),根据吞噬率(phagocytic rate)和吞噬指数(phagocytic index)可判断该细胞的吞噬功能,根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率。

【检测方法】白色念珠菌法、葡萄球菌法、溶菌法、NBT还原试验。

【参考区间】白色念珠菌法:吞噬率91%±5.8%,杀菌率32.72%±7.83%;葡萄球菌法:吞噬率94%,吞噬指数20～30;溶菌法:对大肠杆菌的杀菌率>90%,对金黄色葡萄球菌的杀菌率>85%;NBT还原试验:阳性细胞率>99%。建议实验室最好建立自己的参考区间。

【临床意义】白细胞吞噬与杀菌的能力对于抵抗侵入人体的细菌等病原微生物发挥很重要的作用,是机体抗感染免疫的重要组成部分,主要用于判断机体白细胞的功能状态和诊断白细胞所致的疾病。

1.白细胞吞噬能力降低　主要原因为:①机体免疫功能下降;②营养、代谢和肿瘤因素;③体内有明显抑制白细胞吞噬因素,常见于先天慢性肉芽肿、中性粒细胞异常缺陷综合征、先天性丙种球蛋白缺乏症、粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤,以及补体所致的调理缺陷综合征等,长期使用免疫抑制剂患者也可降低。

2.白细胞吞噬能力升高　常见于细菌感染者,如败血症、骨髓炎、细菌性脑膜炎、化脓性关节炎等,在病毒感染或器官移植排斥反应引起的发热时不升高,可用于鉴别诊断。

杀菌试验用于诊断某些吞噬功能正常,而细胞内杀菌功能障碍或缺乏的病例。某些疾病时患者的白细胞吞噬功能正常,却不能将吞入细胞内的细菌杀死。结果不仅使细菌免受细胞外杀菌因素作用,而且细菌还可随携带的细胞游走,使感染进一步扩散。如慢性肉芽肿、粒细胞过氧化物酶缺乏症等疾病。

七、巨噬细胞吞噬功能测定

【概述】巨噬细胞承担着吞噬、消除细胞内寄生菌、真菌,以及清除衰老的自身细胞的职能,它在特异性体液免疫或细胞免疫应答中都有重要作用,所以巨噬细胞的吞噬消化功能,在一定程度上可以反映机体的免疫状态。

【检测方法】常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒,用斑蝥敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。将巨噬细胞与鸡红细胞悬液在体外混合,温育,涂片,染色,油镜下观察并计数,通过计算吞噬率和吞噬指数来反映巨噬细胞的吞噬功能,并通过观察鸡红细胞的消化程度,判断巨噬细胞的消化功能。

吞噬率=吞噬CRBC的巨噬细胞数/200×100%;吞噬指数=巨噬细胞吞噬的CRBC总数/200。

【参考区间】吞噬百分率61%～64%,吞噬指数1.058±0.049。

消化程度分3级。

Ⅰ级:未消化——CRBC核清晰,浅紫红色,胞质浅红或黄绿色。

Ⅱ级:轻度消化——CRBC核模糊、肿胀、紫蓝色,胞质浅黄绿色。

Ⅲ级:完全消化——CRBC核溶解,染色极淡,胞质中见空泡。

【临床意义】吞噬细胞是机体重要的防护系统之一,吞噬试验可了解受试者巨噬细胞的吞噬功能。有资料表明,恶性肿瘤患者的吞噬百分率、吞噬指数均明显低于正常人,手术切除好转后可以上升;故本试验还可评价恶性肿瘤患者术后免疫水平的变化。

八、细胞因子与细胞黏附因子测定

(一)肿瘤坏死因子测定

【概述】肿瘤坏死因子(TNF)是由巨噬细胞及活化T淋巴细胞分泌的细胞因子。体外发现TNF对肿瘤具有直接溶解和抑制增殖的作用,在体内可引起肿瘤坏死,使肿瘤体积缩小甚至消退。TNF的最大特点是能够专一杀伤肿瘤细胞而无碍于正常细胞。

【检测方法】ELISA、化学发光法、RIA等。

【参考区间】ELISA法1.14±0.04g/L(1.14±0.04mg/ml)。

【临床意义】肿瘤坏死因子可分为TNF-α和TNF-β两种,前者来自单核巨噬细胞,后者由活化T细胞产生,两者有相似致热性。已发现TNF可对众多的组织器官产生生物效应,它是体内细胞因子网络中重要的多功能物质。TNF具有多种生物效应,主要是介导抗肿瘤及调节机体的免疫功能,也是炎症反应介质之一,参与炎症病变的多方面病理变化。测定血清或其他体液中TNF浓度,是基础医学和临床多种疾病的诊疗很有价值的指标。

1.许多肿瘤细胞可产生TNF,因此在多种肿瘤时机体内TNF表达明显升高,TNF又可通过细胞毒作用,杀死肿瘤细胞或抑制某些肿瘤细胞增殖。

2.风湿性关节炎患者的滑膜中有大量TNF。

3.在脓毒败血症、感染性肺炎等严重炎性疾病时血清中TNF含量明显增高;许多寄生虫病患者中TNF也显著改变;艾滋病患者体液中TNF也高于正常人;疟疾抗原、病毒和细菌均可诱导TNF产生,TNF又反过来具有抗病毒、抗细菌、抗疟疾作用。

4.TNF与移植排斥反应密切相关,在患者的血清或尿液中TNF的表达与排斥反应程度呈正相关。

(二)干扰素α、β、γ测定

【概述】干扰素(IFR)是一种广谱抗病毒剂,并不直接杀伤或抑制病毒,而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白,从而抑制病毒的复制;同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力,从而起到免疫调节作用,并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白),是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长,以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

【检测方法】ELISA、RIA等。

【参考区间】因测定方法不同而异。

【临床意义】干扰素分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ三种。机体的许多不同类型的细胞均可产生IFN,如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及造血细胞等。这些细胞受到病毒、细菌、内毒素、原虫等刺激产生IFN。IFN能诱导细胞对病毒感染产生抗性,它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译,从而阻止或限制病毒感染。IFN是目前最主要的具有抗病毒感染和抗肿瘤作用的生物制品。

1.IFN降低　恶性实体瘤患者外周血淋巴细胞产生干扰素的能力明显降低,细胞免疫缺陷的患者IFN产生能力下降,如AIDS患者,这也是导致致死性病毒感染的原因之一。

2.IFN升高　自身免疫患者血清中,IFN水平明显上升,如类风湿关节炎、硬皮病、活动性红斑狼疮。而非自身免疫患者血清中很少能查到IFN改变,因此血清IFN水平测定能区分是否患自身免疫性疾病,以及了解疾病的活动期。

(三)白介素-1(IL-1)

【概述】IL-1又称淋巴细胞刺激因子,由单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和其他类型细胞在应答感染时产生的细胞因子,有IL-1α和IL-1β两种类型,都与免疫球蛋白超家族的同一受体结合,能刺激集落刺激因子、血小板生长因子等细胞因子的产生和使T细胞产生IL-2,在免疫应答和组织修复中起作用。

【检测方法】ELISA、RIA等。

【参考区间】ELISA法0.19±0.06μg/L。

【临床意义】IL-1是重要的炎性介质之一,也是一种热原质成分,具有致热和介导炎症的作用,它主要在细胞免疫激活中发挥调节作用,IL-1受各种刺激因子(包括抗原、内毒素、细菌及病毒等)所诱导,在急性和慢性炎症的致病过程发挥重要作用,并与糖尿病、类风湿关节炎和牙周炎的发病过程密切相关。IL-1参与机体造血系统、神经、内分泌系统的反应,以及某些抗肿瘤的病理生理过程,它还介导急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病及多发性骨髓瘤的发病。IL-1测定依据是它对胸腺细胞的影响,监测IL-1的释放有助于了解机体的免疫调节能力,可为疾病的诊断、疗效观察及预后判断等提供一项可靠依据。

1.IL-1升高　在某些自身免疫性炎症反应,如类风湿关节炎时IL-1参与了关节滑膜、软骨的病理损伤过程,在多种关节炎的关节液中可测出高水平IL-1,在结核和风湿等疾病时血中IL-1升高。

2.IL-1降低　在再生障碍性贫血患者,单核细胞产生IL-1能力明显降低。老龄人或癌症患者外周血中单核细胞产生IL-1能力也低于正常人,因而在感染后不易出现发热等临床症状。

(四)白介素-2(IL-2)

【概述】IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),又名T细胞生长因子(T cell growth factor,TCRF),主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子,是所有T细胞亚群的生长因子,并可促进活化细胞增殖,故为调控免疫应答的重要因子,也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。

【检测方法】ELISA、RIA等。

【参考区间】ELISA法5.0±1.5μg/L。因测定方法不同而异。

【临床意义】IL-2原称T细胞生长因子,是最为重要的淋巴因子之一,在机体复杂免疫网络中起中心调节作用,它能诱导和激活机体多种免疫细胞发挥效应。因此,IL-2在机体免疫应答、免疫调节和抗肿瘤免疫中具有重要作用。IL-2产生或表达异常与临床多种疾病有密切关系,通过测定人外周血、尿液中IL-2水平,或激活淋巴细胞上清液中IL-2水平,可为疾病的早期诊断、预后及疗效观察提供可靠数据。

1.IL-2增强　肿瘤、心血管病、肝病等均可使IL-2水平升高,在器官移植后早期排斥反应时也出现IL-2表达增强和IL-2水平升高。

2.IL-2低下　在多种原发性免疫缺陷病和继发性免疫缺陷病时均可伴有产生IL-2水平和表达IL-2膜受体的能力显著降低,如红斑狼疮、麻风病、艾滋病等。

可溶性IL-2受体(sIL-2R):sIL-2R是由细胞表达产生的IL-2游离受体,它与膜受体竞争IL-2,阻止IL-2与膜受体的结合。sIL-2R作为一种免疫抑制物,能降低机体的免疫力,多种疾病时它在血中水平有明显改变,如:白血病及淋巴系统恶性疾病、肿瘤、AIDS与其相关的免疫缺陷疾病、病毒感染性疾病、器官移植后排斥反应、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮活动期)等患者的血清、尿液、胸腹水等体液中均可检测到有明显增高,其上升水平与疾病的活动期、肿瘤的发展变化、排斥反应程度以及治疗效果都密切相关,因此,对患者体液中sIL-2R水平的动态监测可以反映患者的病情变化。

【注意事项】

1.采集标本时须用不含致热原、内毒素的洁净试管,用血浆时最好EDTA抗凝。

2.溶血、黄疸、脂血标本会干扰测定结果,血清于2～8℃保存应在2d内完成测定,否则应在-20℃下冻存,避免反复冻融。

(五)白介素-4(IL-4)

【概述】IL-4(interleukin-4)是一种由活化的T细胞产生的细胞因子,相对分子质量18 000～20 000,在B细胞生长的早期活化B细胞,使其进入G1期,在B细胞对蛋白质性抗原发生免疫应答时是必需的。IL-4增强MHCⅡ类抗原和CD23(FcεRⅡ)在B细胞上的表达,诱导同种型转换,如促使小鼠B细胞从分泌Ig M、IgG3、IgG2b转变成分泌Ig G1、IgG2a、Ig A和Ig E。IL-4可增强单核吞噬细胞MHCⅡ类抗原的表达;IL-4与IL-3可协同刺激肥大细胞增殖,也可活化细胞毒性T细胞。它被认为是典型的由TH2细胞产生的细胞因子,对T、B淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。

【检测方法】ELISA、RIA等。

【参考区间】因测定方法不同而异,参照试剂盒提供的参考值。

【临床意义】

1.血清IL-4含量测定缺乏疾病特异性。含量过高、过低都反映机体免疫功能的失衡。

2.由于IL4主要由CD4+T细胞中的TH2细胞亚群产生,故测定血清中IL-4水平常用于了解机体TH1/TH2细胞是否处于平衡状态。

(贴彦青　戴二黑　陈　兴)