科学家们发现了一种奇妙的酶连接酶

基因的制备

要进行基因手术，首先要有纯化的单个基因。但是，要分离纯化基因，困难却是很大的。首先，生物DNA分子上的基因种类很多。最简单的DNA病毒有近十个基因，较复杂的病毒有数十到数百种不同的基因。细菌有数千种基因。高等生物的每一个细胞里就有上万种基因。人的基因种类就更多了，每一个细胞里仅仅结构基因一类，就在5万个以上。这些不同的基因，在化学结构上都是由腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）这四种核苷酸组成的，性质极为相近，用现有的物理、化学分离方法不易分开。此外，每种基因的含量极少。比如，人的血红蛋白的珠蛋白基因，有500个碱基对（指A—T或G—C配对），只占人的每一个细胞中DNA分子所含碱基对总数29亿的千万分之一。对这样稀少的东西进行分离纯化，困难是可以想见的。然而，困难并没有吓倒科学工作者。现在，几种巧妙的制备和分离纯化基因的方法已经创造了出来。

1.化学合成法

绕开分离纯化基因的障碍，直接用腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）这四种单核苷酸化学合成基因，应该说是制备基因最理想的方法了。不过，要用这种方法制备基因，难处也不少。首先，要用单核苷酸化学合成基因，必须事先知道基因的一级结构、基因中核苷酸排列的次序。基因的一级结构研究起来十分困难。人们还可以从基因的副本RNA的一级结构，或基因的翻译产物——蛋白质的氨基酸排列顺序，来推定基因的一级结构。这样推定出来的一级结构并不准确。打开密码本看一看就知道，许多氨基酸的三联密码子的第三个核苷酸甚至第二个核苷酸，都可能不止一种。

体外化学合成基因还有一个难处，它不像用酶作催化剂的生物化学反应专一性那样强，副反应很多；合成的片段越长，分离也越困难，产率就越低。因此，目前纯粹使用化学合成方法，只能得到不长的多核苷酸片段。1972年，美国化学合成了20个核苷酸片段。1975年，我国合成了13个核苷酸的DNA分子片段。1976年，苏联合成了一个同样长的DNA分子片段。同年，加拿大合成了包括21个核苷酸的DNA分子片段。这几个国家走在世界合成核苷酸研究的前列。

可是，基因是由数十个、数百个乃至上千个核苷酸组成的。这么短的DNA分子片段，怎么能够构成一个执行完整功能的基因呢？1967年，科学家们发现了一种奇妙的酶——DNA连接酶，解决了这个问题。这种酶开始是在大肠杆菌内发现的。以后，在枯草杆菌里发现了DNA连接酶。1968年，第一次在哺乳类动物（兔）中发现了DNA连接酶。后来，在小牛、小鼠、大鼠、田鼠及人身上发现了DNA连接酶。1971年，科学家们发现，DNA连接酶也存在于豌豆、胡萝卜、荷花等植物及酵母中。研究工作证明，DNA连接酶在各种生物中广泛存在着。

这种DNA连接酶，可以把DNA片段连接在一起。这样，只需在实验室合成许多包含8～15个核苷酸的DNA分子片段，然后用DNA连接酶一步一步地将这些片段连接起来，就能在体外合成我们所需要的基因。1972年，美国的一个实验室用此方法合成了酵母丙氨酸tRNA基因，其长度为77个核苷酸。1976年，这个实验室合成了一个具有生物活性的基因，它包括了206个核苷酸。这个包含着启动子和终止子的全基因——大肠杆菌酪氨酸tRNA基因，于1976年8月送入大肠杆菌中，得到活性表达。

此外，德意志联邦共和国的一个实验室，用同样的方法合成了人类增压素Ⅱ的基因，它含有30个核苷酸，这是第一个合成的人类基因。1975年，美国的另一个实验室，合成了一个包含15个核苷酸的基因——牛胰RNase的S肽基因。这一年，还合成了650个碱基对的兔血球蛋白的基因。

2.物理化学方法

虽然组成遗传密码的四种核苷酸性质极为相近，但也有微小差异。科学家们利用这种微小差异，分离纯化基因。比如，A—T配对和G—C配对之间，就存在着差异。GC对比AT对稳定性提高。用加热或变性试剂处理DNA，双链上AT对多的部位首先变性，双链分开成为单链，由此可以设法将单个基因分离出来。同时，在GC对多的情况下，双链片段的密度就大些。利用这种差别，以极精密的密度梯度平衡超离心分析方法，可以将不同的基因分离开。应用物理化学方法，分离纯化了一些基因。如海胆组蛋白基因，海胆rDNA基因等。

3.生物学方法

科学家们采用变异菌株，来完成分离或筛选的任务。其中，最著名的方法是榴霰弹击法，亦即鸟枪射击法。我们知道，有一种鸟枪子弹灌满了铁砂子，一枪打出去，铁砂子散射开来，可以打死打伤许多麻雀。榴霰弹也是如此。鸟枪射击法就是利用这种射击原理去“命中”某些基因，以绕过直接分离基因的难关。如图3所示。射击基因的“鸟枪”，可以是物理学武器——剪力或超声波，也可以是生化武器——“基因手术刀”。应用这些武器，将DNA切断成为基因水平的很多片段，这些片段再转入大肠杆菌中增殖，然后从众多的菌株中，筛选出专含某种基因的菌株。有人用此方法分离大肠杆菌基因，一下子就得到了40种。这些基因是用剪力切断，然后采用生物学增殖分离的方法获得的。面包酵母咪唑甘油磷脱水酶基因，则是应用“基因手术刀”切割面包酵母DNA，再在大肠杆菌中增殖分裂获得的。关于“基因手术刀”，将在后面谈到。

a—DNA

b—用剪力、超声波或限制酶切成片段

c—将这些片段嵌入载体

d—移入大肠杆菌增殖

e—把大肠杆菌接种在培养基表面

f—筛选出来专含某种基因的菌株

图3　鸟枪射击法示意图

4.酶促合成法

酶促合成法，主要指的是逆转录酶的方法，这是制备基因的一种重要手段。我们知道，DNA并不直接指导合成蛋白质，而是通过RNA进行蛋白质合成的。其中有一种RNA，称为信使RNA。信使RNA是以DNA分子中基因的核苷酸顺序为样板，在RNA聚合酶的作用下形成的。可以说，信使RNA是DNA分子中某些基因的副本。这种形成信使RNA的过程叫转录。最后再由转录了DNA分子上遗传信息的信使RNA，来指导蛋白质的合成。后来，研究发现，这个过程是可以逆转的。在一种叫做逆转录酶的作用下，信使RNA上的核苷酸顺序，可以转录成DNA上的核苷酸顺序。由于信使RNA比较容易提取，人们就利用逆转录的特性来制备基因。我们可以把与我们需要制备的基因有关的信使RNA提取出来，加入逆转录酶和连接酶。在逆转录酶和连接酶的作用下，以信使RNA为样板，合成DNA片段和需要制备的基因。

酶促反应中，常用的酶有大肠杆菌DNA聚合酶I和AMV酶。1957年，一位科学家发现了大肠杆菌DNA聚合酶I。经过长期研究，发现这种酶具有独特的功能。它不仅可以利用DNA模板进行复制，并且可以利用RNA模板进行反转录。有人利用前一种特性，由单链4×174DNA，在体外通过酶促反应合成了4×174RFDNA。人们利用它后一种特性，曾经使用球蛋白mRNA、病毒RNA、奶蛋白mRNA为模板，酶促合成了相应的DNA片段、相应的基因。

1970年，一些科学家发现了一种专一的逆转录酶。他们利用这种酶，以鸭、兔及人的珠蛋白mRNA、免疫球蛋白mRNA和RNA病毒的基因组为模板，通过酶促反应合成了相应的DNA分子片段、相应的基因和基因组。

由于方法上的不断改进，最近还出现了无需经过逆转录或DNA复制，而用mRNA由染色体DNA片段中直接“钓出”基因的技术。用这个方法，制备了纯度极高的卵白蛋白基因，而且收率高达80%～100%。