植物脱毒的原理与方法

任务二　植物脱毒的原理与方法

一、植物脱毒的原理

（1）植物病毒本身不具有主动转移的能力：在一个植物体内，病毒容易通过维管系统而移动，但在分生组织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动只能通过胞间连丝，速度很慢，难赶上活跃生长的茎尖。

（2）在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制。

（3）在植物体内，可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。

（4）在茎尖存在高水平内源生长素，也可能抑制病毒的增殖。

二、植物脱毒方法

（一）茎尖培养脱毒

1.通过茎尖培养脱毒的原理

（1）病毒在植物体内的分布：植物体内部位不同，病毒浓度也不同，离尖端越远病毒浓度越高。茎尖、根尖顶端分生组织病毒浓度低，甚至不带病毒，并且茎尖、根尖无维管系统，病毒无法运动。

（2）茎尖大小与脱毒效果：茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比关系，茎尖越大，脱毒效果越差。茎尖分生组织不能合成自身需要的生长素，但下部叶原基可以提供，因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。顶端分生组织即生长点（最大直径0.1 mm），也可以是带1～3个幼叶原基的茎尖（0.3～0.5 mm），最适合作外植体，脱毒效果最好。

2.茎尖脱毒方法

（1）取样与消毒：可直接在选定的植株上采顶芽与侧芽进行消毒接种。消毒方法是剪取顶芽梢段或侧芽3～5 cm，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%的酒精中浸泡30 s左右，再用1%～3%的次氯酸钠或5%～7%的漂白粉溶液消毒10～20 min，最后用无菌水冲洗材料4～5次。

（2）茎尖剥离与接种：在双筒解剖镜下，用解剖刀尖剥去幼叶，露出生长点后，用刀尖切下带1～2个叶原基的生长点（0.3～0.5 mm），再用解剖针将切下的茎尖转接到培养基（一般通常采用半固体培养基，多选用MS、White和Morel培养基，培养基中加入IAA、NAA、KT或椰乳，适当配合GA可促进茎尖外植体的生长与分化，而应避免使用2，4-D）上，顶部向上，每个试管可接1～2个茎尖。茎尖培养最好采用液体培养中的纸桥培养方法，利于外植体的通气、生根，并能消除固体培养基琼脂中杂质对茎尖生长和脱毒效果的不利影响。为防止茎尖失水，需用无菌水润湿滤纸。操作时注意随时更换滤纸和接种工具，剥取茎尖时切勿损伤生长点。

（3）培养：温度控制在（25±2）°C；湿度控制在70%～80%；光照控制在10～16 h/d（光照度为1 500～5 000 lx）；60 d左右，大茎尖再生出绿芽，0.1～0.2 mm的小茎尖则需90 d以上，期间应更换培养基，提高6-BA浓度，可形成大量丛生芽。

（4）生根诱导：将2～3 cm的无根苗转入生根培养基（1/2MS+IBA 0.1～0.2 mg/L）继续培养1～2个月即可生根。

3.影响脱毒效果的因素

（1）母体材料病毒侵染的程度：只被单一病毒侵染的植株脱毒较容易，而复合侵染的植株脱毒较难。

（2）起始培养的茎尖大小（见表6-2和6-3）：一般取不带叶原基的生长点培养脱毒效果最好，带1～2个叶原基的茎尖培养大约可获得40%的脱毒苗，而带3个以上叶原基的茎尖培养一般获得脱毒苗的频率就大大降低。通过二次茎尖培养，脱毒率可达100%。

表6-2　茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响

表6-3　用于脱毒的适宜茎尖大小

（3）外植体的生理状态：一般来讲，顶芽的脱毒效果比侧芽好，生长旺盛季节的芽比休眠或快进入休眠的芽的脱毒效果好。另外，还应防止脱毒苗再度感染病毒。

（二）热处理脱毒

1.热处理脱毒原理

热处理并不能杀死病毒，但一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35～40 °C）钝化失活，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，失去传染能力。热处理作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。

（1）温汤浸渍处理脱毒法：材料置于50 °C左右热水中浸渍几十分钟到数小时。其特点是简单易行，成本低，但易使材料受伤，适用于甘蔗、木本植物和休眠器官的处理。

（2）热空气处理脱毒法：将植物用35～40 °C的热空气处理2～4 周或更长时间。其特点是损伤较小，操作简便，但需严格控制温度和时间，适用于大多数植物。

（3）热处理结合茎尖培养脱毒法：目前常采用将热处理和茎尖分生组织培养结合起来脱毒的方法。其特点是既可缩短热处理时间，提高植株成活率，又可剥离较大的茎尖，提高茎尖培养的成活率和脱毒率。适用于大多数植物，并可除去一般培养难以去除的纺锤块茎类病毒。

2.热处理脱毒的优缺点

（1）优点：方法简单，效果明显。

（2）缺点：① 具有局限性，不能去除所有病毒，只对圆形病毒（苹果花叶病毒）或线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效，而对杆状病毒（千日红病毒）无效；② 热处理后只有小部分植株能够存活，极易使植物材料受热枯死，造成损失；③ 延长热处理时间，病毒钝化效果好，同时也可能会钝化植物组织中的抗性因子而降低处理效果。

（三）愈伤组织培养脱毒

将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病毒植株的方法，即愈伤组织培养脱毒法。经过多次继代的愈伤组织中病毒的浓度下降，甚至检测不出病毒。

部分愈伤组织细胞不带病毒可能有以下两方面的原因：一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快，而病毒复制速度较慢，赶不上细胞的繁殖；二是愈伤组织发生了抗病毒突变。

（四）珠心胚培养脱毒

柑橘类种子为多胚种子，除具有合子胚外还有珠心胚，病毒一般不通过种子传播，故通过珠心胚培养获得的再生植株无病毒。珠心胚培养对柑橘鳞皮病、速衰病、裂皮病、脉突病等十分有效。

【知识拓展】

柑橘珠心胚培养：取花后约7周的幼果胚囊，接种在（25±2）°C黑暗条件下培养30 d，再转光培养，光照时间12 h/d，光照度为1 000 lx。3～4周发生球形胚和愈伤组织，9～10周分化子叶，苗高3 cm左右移植到营养钵蛭石基质中培养，7周左右移栽到土中。

（五）微尖嫁接脱毒

微尖嫁接脱毒是指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖（0.14～1.0 mm，带3～4个叶原基），以培养脱毒苗的技术。微尖嫁接脱毒主要应用于茎尖脱毒培养生根困难、不能形成完整植株的柑橘、苹果、桃等。茎尖来源主要有成年无病毒植株的茎尖、热处理（应用最广）或温室培养植株的茎尖、脱毒试管苗茎尖等。

微茎尖脱毒的主要程序：无菌砧木培养→茎尖准备→嫁接→嫁接苗培养→移植。

（1）砧木培养：新鲜果实种子去种皮后接种于MS无激素的培养基上，在（25±2）°C黑暗条件下培养2周，再转光培养。

（2）茎尖准备：茎尖取热处理的植株茎尖，消毒和剥取同“茎尖培养脱毒”。

（3）嫁接：取砧木，切去过长的根，切顶留1.5 cm左右的茎。在砧木附近顶处一侧切一“U”形切口达形成层，用刀尖挑去切口部皮层。将茎尖移置砧木切口部，茎尖切面紧贴切口横切面。

（4）嫁接苗培养：一般采取液体纸桥培养。先在纸桥中开一小孔，将砧木的根通过小孔植入液体培养基，按常规光照培养管理。开始低光照（光照度为800～1 000 lx），长出新叶后提高光照度。

（5）移栽：培养3～6周，当有2～3叶时按一般试管苗移植的方法移入蛭石、河沙、椰壳等基质中培养。