植物基因的转化方法

18．3．2　植物基因的转化方法

植物转基因技术（gene transfer）也称遗传转化技术（genetic transformation），是植物基因工程的一个重要组成部分；它通常是指将依据人们一定的需要已经分离、克隆并组建成一定载体形式的外源基因，借助于物理、化学或生物的手段，转入受体植物细胞，实现在新背景下（如细胞、组织、整株水平）表达和遗传的过程。它不仅为基因的表达调控和遗传的研究提供了一个理想的实验体系，更重要的是为植物，尤其是农作物的定向改良和分子育种提供了一个有效的途径和方法。因此，它不仅受到生物学家和育种学家的高度重视，也得到了物理学家和化学家的广泛关注。

1983年转基因植物问世迄今不过二十多年，但转基因技术的发展却十分迅速，转基因成功的植物已达到近两百种，包括烟草、番茄、胡萝卜、向日葵、油菜、亚麻、莴苣、豇豆以及水稻、稞麦等。被批准进行田间试验的转基因植物在全世界已超过1　000例，某些目标产品已经或正在进入商业市场，专利报道层出不穷。通过基因工程改良作物在未来农业中日益显示出巨大的潜力。对转基因技术按属性分类，可以分为生物学方法、化学方法、物理方法以及种质系统介导的基因转移法，下面分别予以介绍。

18．3．2．1　生物学方法

A．土壤杆菌介导法

根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌同属土壤杆菌科，寄主范围十分广泛。它们在自然状态下可以通过伤口浸染植物，分别导致冠瘿瘤和毛发根的发生。其中冠瘿瘤的产生是由于根癌土壤杆菌中的一种与肿瘤诱导有关的质粒（Ti质粒）上的一个DNA片段（T－DNA）转移入植物细胞。毛发状根的形成与冠瘿瘤的形成很相似，它是由发根土壤杆菌中的一个Ri质粒上的一个片段转入植物细胞中诱发的。Ri和Ti质粒上只有两个区段是T－DNA转移所必需的，即Vir区和T－DNA的边界序列，T－DNA编码的所有基因可以用人们所需的目的基因取代，而不影响转移过程。

土壤杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，其机制从分子水平已基本得到阐明，土壤杆菌在附着到植物的伤口组织上后，通过两者之间的相互作用，土壤杆菌可以形成纤维素小纤丝将其“固定”在植物细胞壁上，同时诱导受伤的植物组织释放乙酸丁香酮（AS）和羟基乙酸丁香酮（HOAS）等与诱导Ti质粒上Vir区表达有关的酚类物质；Vir区基因被激活后，一些特异的参与形成T－DNA中间体的蛋白质得以合成，这些蛋白质切割T－DNA形成单键的T－链蛋白质复合体，并协助单链的T－DNA穿过细菌细胞膜、细菌细胞壁、植物细胞壁、植物细胞膜和核膜，再进一步整合入植物基因组，从而完成植物的转化。

Ti质粒是一个很好的植物遗传转化载体，在植物的遗传转化的实际操作中，要删去野生型的Ti质粒上与致病有关的基因。在改造Ti质粒的过程中发展出了共整合型载体和双元载体两套载体系统。共整合载体系统使用无毒的Ti质粒作为供体载体，它提供Vir区用于转移T－DNA的功能，外源基因先被克隆到一个中间载体上，中间载体被导入土壤杆菌后与供体载体发生同源重组形成共整合体。双元载体的基本特点是使用两个彼此相容的Ti质粒，其中一个是含有T－DNA转移所必需的Vir区的质粒，即辅助载体，另一个是含有T－DNA边界区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，即双元载体（bianry vector），这两个质粒不需同源区，便于构建而得到广泛的应用。

土壤杆菌介导的植物遗传转化的基本程序是：先对目的基因进行分离和鉴定，然后构建植物表达载体，最终将目的基因插入T－DNA区，通过土壤杆菌Ti介导，将外源目的基因导入植物细胞，以获得转基因植株。在植物遗传转化技术发展的初期，研究者发现玉米、水稻、小麦等重要的单子叶植物对土壤杆菌不敏感，推测原因是这些单子叶植物不能形成足量的诱导Vir区基因表达的酚类化合物。1994年Hiei成功地利用土壤杆菌介导转化水稻以来，玉米、小麦等也用土壤杆菌介导转化成功，从而使土壤杆菌介导的单子叶植物的转化成为许多实验室的常规的转化手段。Hiei指出成功转化水稻的要点在于将含有由盾片产生的愈伤组织和活跃分裂的组织（未成熟胚）与土壤杆菌共培养，并添加乙酸丁香酮，影响转化率的因素包括材料的基因型、取材部位及其年龄、载体、土壤杆菌菌株、筛选标记基因、筛选用试剂及组培条件。这种方法目前在油菜、大豆、甘蓝、黄瓜、秈稻等植物中获得成功。目前较成熟的土壤杆菌介导的植物遗传转化法有叶盘共培养法、真空渗入法、原生质体法、原生质球法及脂质体法等。

叶盘共培养法是双子叶植物较为常用的，简单有效的方法。选取健康的无菌苗，用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶圆盘与进行带有目的基因的土壤杆菌液进行短期共培养，土壤杆菌通过伤口使携带外源目的基因的Ti质粒进入植物细胞，使外源目的基因整合到植物基因组中。自从1985年Horsch等建立土壤杆菌与叶盘共培养转化方法以来，这一培养系统广泛用于植物细胞、愈伤组织、茎切段等离体材料的转化。

真空渗入法是将适宜转化的健壮植株浸于装有携带外源目的基因的土壤杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使土壤菌通过伤口感染植株，在土壤杆菌的介导下，发生遗传转化，这种方法在用于拟南芥、大白菜、油菜等均有成功的报道。它是一种简便、快速、可取而且不需要经过组织培养即可获得大量转化植株的基因转移方法，具有良好的研究与应用前景。但是，由于土壤杆菌只能侵染大部分的双子叶植物和少数单子叶植物，使农作物、尤其是单子叶禾谷类粮食作物的基因工程受到很大限制。

B．植物病毒介导法

植物病毒载体转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。植物病毒作为载体的研究仍处于初级阶段。目前正在研究的植物病毒载体系统主要有3种：单链RNA植物病毒载体系统，单链DNA植物病毒载体系统和双链DNA植物病毒载体系统。植物病毒载体系统和根癌土壤杆菌Ti质粒基因转化系统相比，主要有以下优点：①病毒具有高效的自我复制能力，转化植物中能得到高拷贝的外源基因，有利于外源基因的表达和功能实现。农杆菌Ri质粒基因转化外源基因蛋白质产物一般低于细胞可溶性蛋白的1%，而病毒载体感染的外源基因蛋白产量远高于1%，当转化植物的目的是为了使之生产大量某种蛋白或次生代谢物时，病毒转化法就显示出极大的优越性。②病毒能系统地侵染植物，避免了单细胞、原生质体或组织、器官的转化和再生培养，能够较快地获得转基因植物。在许多多年生作物中，特别是从种植到收获要相隔许多年的植物，比如果树，对每一棵果树接种一种病毒以获得对另一种病原病毒的抗性，肯定要比用新的抗病品种替代所有果树，并等待若干年以后再收获要经济得多。③植物病毒的寄主范围较广，因而由某种病毒基因组构建的载体可用于多种不同植物的转基因操作。病毒载体也具有缺点：病毒载体不能把携带的外源基因整合到寄主染色体上，也不能按孟德尔规律传递给后代；病毒载体仍然存在致病的可能性，可能会诱发植物产生病害；由于病毒载体本身的不稳定性，因此病毒载体中的外源基因很容易丢失。土壤农杆菌介导法和植物病毒介导法所涉及的知识面较广，操作要求高且比较繁琐，所以近年来，各种DNA直接导入的物理、化学方法的研究和应用日益普及。

18．3．2．2　化学方法

化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。初期的化学转化是从促进原生质体融合的方案衍生而来的，只是近年来才建立了有效的化学转化技术。

A．聚乙二醇（PEG）法

PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇（PEG）、多聚－L－鸟氨酸（pLO）、磷酸钙及高pH值条件可诱导原生质体摄取外源DNA分子，PEG法的主要优点是利用原生质体本身具有摄取外来物质的特性导入外源基因，对细胞伤害少，获得的转基因植株来自一个细胞，避免了产生嵌合转化体；主要缺点是在大多数植物中建立原生质体培养和再生系统十分困难，转化率低，原生质体再生植株产生较多无性系变异。尽管如此，PEG直接转化法目前仍具有一定应用价值，我国科学家用PEG直接转化法在水稻、高粱、玉米、小麦等重要粮食作物中都获得了转基因植株。在杨树、火炬松、白云杉转化中也取得了成功。

B．脂质体法

脂质体法是根据生物膜的结构功能特性用人工合成的脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。包在脂质体内的DNA、RNA核酸大分子，在转移到植物细胞过程中免受细胞内核酸酶的降解，并能更有效地进入原生质体。近年来，美国推出了一种新型商品化脂质体——转化脂，操作简便，能有效地转化动、植物细胞。我国科学家用此方法将人的干扰素基因导入水稻获得转基因水稻，并检测到干扰素在水稻细胞中的有效表达，转化频率提高到14%。另外，脂质体应用于介导植物病毒的转化上，可以提高病毒的感染率。脂质体法与PEG法、电激法都有相似之处，甚至经常联合使用。

18．3．2．3　物理方法

物理转化方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞。它不仅能够以原生质体为受体，还可以直接以植物细胞乃至组织、器官作为靶受体，因此比化学方法更具有广泛性和实用性。常用的物理方法有电激法、超声波法、激光微束导入法、显微注射法、基因枪轰击法以及正在发展中的低能离子束介导法等。

A．电激法

电激法（也称电击穿孔法）是20世纪80年代初发展起来的一种遗传转化技术，主要原理是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电击穿孔”，细胞膜上会出现短暂可逆性开放小孔，为外源物质提供了通道，借此可以导入外源DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒等多种生物大分子以及核苷酸和染料等多种小分子。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果。我国科学家李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的转化，现在这一方法已被广泛应用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更具有应用潜力。电激法除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便、转化效率较高、特别适于瞬时表达的特点。缺点是造成原生质体的损伤，且仪器也较昂贵。近年来对电激法的应用又有了新发展，通过电激法直接在带壁的植物组织和细胞上打孔，然后将外源基因直接导入植物细胞，现已在水稻上获得转基因植株。使用该技术可以不制备原生质体，提高了植物细胞的存活率，而且简便易行。

B．超声波法

超声波法转基因的基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源DNA进入细胞。此转化途径可以避免脉冲高电压对细胞的损伤作用，有利于原生质体存活，目前被认为是一种有潜力的转化途径。超声波所具有的机械作用、热化作用和空化作用、穿透力大、在液体和固体中传播时衰减小、界面反射造成叶片组织受超声波作用的面积较大等特点，可能是造成高效短暂表达和稳定转化的重要原因，这些特点使超声波转化具有下列优点：操作简单，设备价廉，不受宿主范围限制，转化率高等。与其他直接转化方法相比具有更大的应用潜力，但该转化系统尚待进行更深入的研究，使之完善。

C．激光微束导入法

激光微束照射是近代科学发展的新兴技术，并由此建立了激光生物学。激光微束法导入外源DNA的基本原理，是利用激光微束精确的定向性和损伤小的特点，将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微速照射培养细胞后，在细胞膜上可形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。激光导入法与其他转化系统相比具有以下特点：①操作简便，整个导入过程能在较短的时间内完成；②转移效率高，每分钟可操作103个细胞，比人工的显微注射法效率提高20倍，比化学法提高多个数量级，但与电激法、基因枪轰击法相比转化效率还是低的，在稳定性、安全性等方面也较差；③无宿主限制，可适用于各种动植物；④对受体细胞正常的生命活动影响小；⑤受体的类型广泛；⑥较常规的显微注射技术定位更准确，可进行细胞器的基因转化；⑦穿透力强，深度方向可作调整。

D．显微注射法

显微注射法原理比较简明，是利用显微注射仪或在显微镜下用特制的超微毛细管，将少量的外源DNA注射到植物细胞或原生质体的细胞质或细胞核中。该技术在动物细胞或卵细胞的基因转化方面应用很多。植物细胞的显微注射近年来发展很快，已经成为当今一个重要的植物基因工程的新途径，已发展出一套完整的技术，烟草、油菜、苜蓿等植物的原生质体转化率高达60%以上，缺点是操作麻烦，工作效率低，每一次只注射一个细胞，并依赖于原生质体或细胞的低密度培养技术，而且多数实验的表达频率不稳定。

E．基因枪轰击法

基因枪法又称微弹轰击法，是用高速度的金属微粒将核酸分子引入活细胞中的一种遗传转化技术。它是继农杆菌介导转化法之后又一个最广泛应用的遗传转化技术。1987年研制成功火药基因枪。此后，研究人员从基因枪的转化效率和成本等方面考虑，又相继推出了放电基因枪以及用其他动力驱动核酸分子与金属微粒的基因枪。基因枪技术的基本原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的钨（或金）等金属颗粒加速，射击真空室中的靶细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入靶细胞中的目的。基因枪转化技术将遗传转化技术推向了一个新高潮，它具有的优点是：①无宿主限制，在许多农杆菌介导法难以成功的单子叶禾本科农作物中取得了一系列突破性进展；②靶受体材料的类型广泛，PEG介导法、脂质体介导法、电激法等都需要以原生质体作为受体材料，不易培养再生，培养周期长，对植物基因型依赖性强，基因枪法可以选用易于再生的受体，绕过了原生质体再生的困难；③操作简便快速。基因枪转化技术也有其不足之处，与土壤杆菌介导法相比，无论是对于双子叶植物还是单子叶植物，基因枪转化技术的转化频率还是很低的，转化后外源DNA的结构变化复杂，拷贝数多，遗传稳定性较差。

F．低能离子束介导法

这种技术的原理是利用离子束对植物细胞壁的溅射和刻蚀作用，造成受体植物表面可修复的损伤和穿孔，形成许多微通道，为外源基因进入细胞提供了路径；离子束带有正电荷，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，并在微通道内形成正电性，有利于吸引带负电的DNA分子进入细胞；离子束对细胞内遗传物质造成可修复的损伤，增加了外源基因连接到细胞染色体中去的概率。离子束介导转基因的主要优点是以成熟胚为材料，不受季节限制，不需要复杂的原生质体培养技术；操作方便，可同时大批量处理；离子束具有高度集束性和方向性，能量和射程可控性强。其缺点是转化效率较低，外源基因进入细胞不稳定性较高。

18．3．2．4　种质系统介导法

种质系统介导法是借助生物自身的种质细胞为媒体，特别是植物的生殖系统细胞（花粉、卵细胞、子房、幼胚等）以及细胞的结构来实现转化的目的。它不同于载体转化，也不同于物理或化学的直接转化法。不需要经过植物组织、细胞、原生质体培养过程，在植物整体水平上进行转化，方法简便，常与常规育种紧密结合。

A．花粉管通道法

花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。这一技术原理可以应用于任何开花植物，不需要经过植物组织培养过程。该法的主要缺点是盲目性大，重复性差，受开花季节的限制，用于无性繁殖和杂合植物。其转化机制一直充满着争论和分歧，但是通过这一技术已经培育了多种植物的新品种，并已推广应用。

B．生殖细胞浸泡法

浸泡法是将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗悬细胞培养物等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并稳定地整合表达与遗传。因为种子具有自然的形态建成能力和遗传传递能力，不存在再生植株的困难，而且种子取材方便，不受季节限制，因此种子是浸泡法转化的良好试材。20世纪80年代以来，许多国家的研究人员利用种子浸泡法实现了外源基因的遗传转化。尽管浸泡法有许多优点，特别是成熟种子浸泡法可以说是高等植物遗传转化技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法，它不需涉及昂贵的仪器及组织培养技术，容易为人们接受。但是，浸泡法有其致命弱点，即分子生物学方面的证据不足。采用种子（或胚）的浸泡法还有一个让人费解的问题，即DNA是怎样通过多层细胞壁的阻碍达到分生细胞的？有关的理论基础尚在研究之中。

C．胚囊、子房注射法

胚囊、子房注射法是指用显微注射仪将外源基因DNA溶液注入胚囊或子房中，由于胚囊和子房中产生高的压力和卵细胞的吸收使外源基因进入受精的卵细胞，从而获得转基因植株。

18．3．2．5　叶绿体的遗传转化

叶绿体作为细胞核之外的一个遗传物质库，具有基因拷贝数高，在许多植物中是母系遗传的特点。因此用它可大量地表达外源基因，且可以克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低，位置效应及由于核基因随花粉扩散而带来的不安全性等问题。要建立有效的叶绿体遗传转化系统，必须考虑两个因素：高等植物细胞内叶绿体的基因拷贝数很高，必须建立高效的选择系统使转基因植株完全同质化；要克服叶绿体内外膜的屏障。

目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这非常有利于外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组的研究。现在构建的叶绿体表达载体基本上属于定点整合载体；构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片段或定位片段（targeting fragment）。当载体被导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组，就可以将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。在以改良作物为目的的叶绿体转化中，要求同源重组发生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又不至于破坏插入点处原有基因的功能。现有的工作都选用了相邻的两个基因作为同源重组片段，当同源重组发生以后，外源基因的插入在两个相邻基因的间隔区，从而保证了原有基因的功能不受影响。到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯等植物中相继实现了叶绿体转化，这一转化技术已开始成为植物基因工程中新的研究热点。

McBride等于1995年首次将Bt CryIA（c）毒素基因转入烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3%～5%，而通常的核转化技术只能达到0．001%～0．6%。Kota等在1999年将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草叶绿体，发现毒蛋白在烟草叶子中的表达量很高，占可溶性蛋白的2%～3%，比细胞核转入高出20～30倍，转基因烟草不仅能抗敏感昆虫，而且能够杀死那些产生了高抗性的昆虫。Staub等在2000年将人的生长激素基因转入烟草叶绿体，其表达量竟高达叶片部蛋白的7%，比细胞核转化高出300倍。这些实验说明，叶绿体表达载体的构建和转化，是实现外源基因高效表达的重要途径之一。

从方法学上讲，上述各种转基因方法各有其优缺点及适用范围，农杆菌法及基因枪法目前在应用上的主导地位，并不意味着对其他方法的否定，也并不意味着排斥其他技术方法的创新。相反，在很多情况下是互补的。例如已有报道表明，在农杆菌感染前用基因枪轰击，以增加植物组织的创伤点，可促进农杆菌的侵染并提高转基因效率。本研究也表明离子束注入愈伤组织的一侧更容易被农杆菌感染导入外源基因。脂质体应用于植物病毒介导的转化上，可以提高病毒的感染率。脂质体法与PEG法、电激法常联合使用，也有利于提高转化率。

随着分子生物学高新技术的发展，也许人们会产生这样的疑问，是否意味着传统农业育种技术不再重要。其实不然，转基因技术只是育种中的一个环节，虽然是其中很关键的一环，但很多工作还需要与常规育种技术结合起来才能发挥作用。通过基因工程技术得到的是一种人工种质新材料，而不是生产上可以立即应用的新品种，它必须与常规育种紧密配合，经大田试验将转基因植物的外源目的基因持续遗传给后代或通过有性繁殖转移到别的品种上去。此后还必须与作物栽培紧密配合，才可能最终取得经济效益和社会效益。所以，分子生物学高新技术与传统农业的关系，是互补和嫁接的关系，而不是取代或排斥的关系，两者相辅相成，将是一种必然的发展趋势。