花药和花粉培养的方法

1）花药培养

花药培养在植物离体培养中占有重要地位。据不完全统计，已有23科52属约300种高等植物的花药培养获得了成功，其中包括大麦、玉米、大豆、梨、橡胶、桃、杨树、苹果、荔枝、龙眼等。

图3.2　雄核发育途径［体积较大的细胞核为营养核（V），体积较小的为生殖核（G）；AG表示生殖核进行持续的细胞核分裂；A-V表示营养核进行持续的细胞核分裂；A-VG表示营养核和生殖核都进行持续的细胞核分裂］

花药培养较花粉培养简单，主要步骤如下：

（1）取材。镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。

（2）消毒。70%酒精擦洗花蕾表面，或70%酒精浸泡30～60 s后在1%次氯酸钠溶液中浸泡10～20 min或在0.1%的氯化汞溶液中消毒3～10 min，无菌水冲洗3～5次。

（3）培养。固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤组织，并突破花药壁表面，形成突出物（2～3周）后转入分化培养基培养，形成小植株。

图3.3　花粉植株形态发生的方式

2）花粉培养

（1）花粉分离与纯化。花粉分离与纯化的常用方法有3种：①自然散落法（漂浮培养散落小孢子收集法），将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。②挤压法，在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。③机械游离法，包括磁搅拌法（即用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药）和超速旋切法（即通过搅拌器中的高速旋转刀具搅碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来，此法应用最广）。对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛和30%蔗糖梯度离心获得纯化小孢子（见图3.4）。

图3.4　30%蔗糖梯度离心小孢子混合物

（a）梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）；（b）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子）

图3.5　看护培养示意图

（2）花粉培养的方式。目前可以用于花粉培养的方式有：①平板培养，花粉置琼脂固体培养基上培养。②液体培养，花粉悬浮在液体培养基中培养，需振荡，以利通气。③双层培养，花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。④看护培养，利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖（见图3.5）。该愈伤组织称为看护愈伤组织。⑤微室培养，利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养（见图3.6）。

图3.6　微室培养示意图

⑥条件培养基培养，在培养过花药的液体培养基或含有失活花药提取物的培养基上培养，包括花药条件培养、子房条件培养等。