条件致死突变

本泽的研究大大推动了绘制噬菌体遗传学图的研究，1946—1960年，他分离到了许多有关噬菌斑形态和寄主范围的突变型。然而，随着遗传分析的深入，人们清楚地看到分离到的突变几乎都集中于噬菌体基因组中相当狭小的区段，这些都是被高度选择的突变群。为什么会出现这样的情况呢？理由十分简单，因为绝大多数涉及核酸复制和蛋白质合成的基因，对噬菌体来讲都是生死攸关、必不可少的，带有这类基因突变的噬菌体都是致死的，是不易被发现和分离的。

1960年埃德加（R.Edgar）和爱泼斯坦（R.Epstein）首次分离到T4的条件致死突变（conditional lethal mutation）。条件致死突变型噬菌体只能在特定的条件或者叫作限定条件下才会表现致死的表型，而在非限定的条件或者叫作允许条件下则呈现出野生型表型。这种突变为我们提供了一条研究对生命活动生死攸关的基因的途径，我们可以在许可条件下繁殖突变型，在限定条件下研究突变对噬菌体复制、增殖和形态发生的影响。

条件致死突变可分为两类：一类是温度敏感突变（temperature sensitive mutant，ts），简称ts突变；另一类是寄主范围突变（host range mutant）。下面主要以ts突变为例，来说明致死突变的筛选方法及其在遗传分析中的作用。

ts突变一般是错义突变（missense mutation），往往只是DNA分子中一对碱基的替代，并由此造成了由这段DNA编码的蛋白质中一个氨基酸的取代。蛋白质初级结构的这种改变，使它只能在许可温度下，才能保持功能态的二级、三级和四级结构来行使蛋白质的正常功能。相反，在限定条件下，该蛋白质会因结构异常而降解失活，导致噬菌体复制和增殖受阻，产生致死表型。ts突变型的分离方法很简单，可先接种100个左右的噬菌体于敏感菌平板上，并置于许可温度下培养数小时，待菌板上出现小的噬菌斑后，将平皿移至限定温度培养。这时野生型噬菌体继续复制、增殖和感染过程，使噬菌斑继续扩大。而ts突变型噬菌体则中止了复制和增殖，噬菌斑仍然是比较小的。我们只要挑出小噬菌斑中的噬菌体就可进一步分离得到ts突变型。分离过程如图2-18。

条件致死突变的发生和分布是随机的，在噬菌体T4的所有基因中都曾经发现过这类突变。对病毒遗传学家来讲，条件致死突变是研究病毒形态发生的“无价之宝”。人们可以通过分析在限定条件下噬菌体的条件致死突变体在寄主细胞中特定的功能缺陷来研究野生型基因，即正常基因的功能。具体方法是仔细探查感染了突变噬菌体的细菌细胞中，噬菌体发育的哪个过程被阻断了，或者是哪种该出现的结构组分没有出现，然后据此来推测相应的正常基因的功能。例如，噬菌体T4的34号突变体能在寄主细胞中合成尾丝以外的各种病毒结构组分。又如，23号突变体能合成尾部和尾丝，但不能合成头部。可以推测34号突变发生于编码尾丝蛋白的基因内，而23号突变发生于与头部外壳蛋白有关的基因内。

与rⅡ区的顺反位置效应测试一样，也可以用顺反效应测试技术来确定两个或几个突变是否属于同一个顺反子，是否执行相同的功能。这种在寄主细胞中做噬菌体功能互补实验，检测的是活细胞内蛋白质水平的功能互补。不久，埃德加和伍德（W.Wood）又进一步发展和建立了在细胞外，或者叫体外的功能互补实验。他们将携有不同形态组分合成缺陷突变的噬菌体感染后的细菌无细胞抽提液混合在一起孵育，观察能不能产生完整的噬菌体。例如，当他们将23号无头突变体感染后的细胞提取液和34号无尾丝突变体感染后的细胞提取液混合孵育后，竟会在试管中出现由34号突变体合成的头部和23号突变体合成的尾部装配成的有感染力的完整噬菌体T4（图2-19）。

图2-18　温度敏感致死突变型噬菌体的筛选过程

图2-19　噬菌体T4的条件致死突变体的体外功能互补实验（引自G.S.Stent）

埃德加和伍德把在细胞内和细胞外所做的互补实验资料汇集成了T4条件致死突变基因连锁图（图2-20）。可以看到许多功能相关的基因在染色体上是成簇成丛排列的，如与DNA合成有关的基因大多集中在一侧，而与头部、尾部和尾丝等形态发育有关的基因大多集中在另一侧。

体外互补实验也曾发现过“例外”，如在13号突变体感染的细菌细胞内似乎也有头部、尾部和尾丝，但没有成熟的噬菌体。将13号突变体感染的细胞提取液分别与头部完整的或尾部完整的突变体感染过的细胞提取液分别混合孵育做互补实验，结果只有与头部完整的一组混合孵育才会有成熟的噬菌体产生。这表明13号突变体的头部是不完整的，同时也表明头部完善化这个功能必定在头尾装接之前完成，这就提示噬菌体的形态发生有一定的时序性。为了证实噬菌体的结构组分和形态发生的时序性，埃德加和爱泼斯坦将不同的ts突变体在感染寄主细胞后的不同时间从许可温度移至限制温度，发现对每一个ts突变来讲它的功能表达都存在一个时阈，过了这个时阈，限制温度就不再影响噬菌体发育和成熟了。这说明尽管大多数ts突变是生死攸关的，但它在发育过程中的作用是有时间特异性的。显而易见，这种时间特异性是和基因表达的时空差异相联系的。

图2-20　噬菌体T4的条件致死突变基因连锁图（改自G.Mosig）

归结起来，上述各项研究说明染色体不是简单的基因集合体，而是一个基因的有序载体。这个有序载体的组织原则是使一系列功能相关基因在特定的时间和空间得以协调表达。这种结构与功能表达一致的有序结构一经建立，就会在生物演化过程中形成某种选择优势。此外，研究还表明，实际上从各种经ts突变体感染的细胞裂解液中分离到的就是噬菌体各组分的零配件，或者叫作“部件”，当这些部件混合孵育后，就会自动装配成完整的噬菌体，而并不要求完整的噬菌体作为发育的“模板”，这种涉及数十种基因产物自动装配的现象在生物界也许是比较普遍的。例如，在大肠杆菌的核糖体30S亚基的自动组装中也被证实，30S亚基的组装涉及一种16S的rRNA和21种蛋白质。