单核苷酸多态性对细胞色素酶活性的影响

本节将以F186L氨基酸突变对于CYP1A2酶活性作用的研究为例，介绍分子模拟方法在研究SNPs对细胞色素P450酶的活性影响中的应用。

8.5.1 CYP1A2简介

CYP1A2是细胞色素P450酶1家族中比较重要的一个成员，据估计该酶可以代谢20%左右的临床药物。2007年，利用X晶体衍射方法CYP1A2和特异性抑制剂α奈黄酮分子结合的晶体结构被测定。与其他细胞色素P450酶蛋白的结构做比较，CYP1A2的二级结构同样以α螺旋为主，总共包含有1～12个α 螺旋（用字母A～L表示），此外还包括4个β折叠（用数字1～4表示）。所有这些二级结构将进一步折叠成细胞色素P450酶结构中的保守区域和CYP1A2特有的区域。保守区域主要包括与血红素辅基相联结的区域以及与提供电子的细胞色素P450还原酶和细胞色素b5还原酶连接的区域，而特有区域指的是CYP1A2所具有的狭窄且扁平的活性中心。

由于CYP1A2的活性中心位于蛋白内部，因此参与到CYP1A2催化反应的一些分子如水分子、氧分子和底物分子在反应前必须首先通过连接于蛋白表面和活性中心的底物通道进入到酶活性中心里，而反应后得到的产物也可能通过分子通道而被排出活性中心之外。最近，许多实验和计算方法对于这些分子通道进行了研究，并证实了相关的底物通道、水通道和产物通道的存在。同时，CYP1A2活性也与遗传水平上发生的氨基酸改变密切相关，表8-7总结了目前已经在实验中证实的一些由于氨基酸突变而引起的CYP1A2活性变化及在它们在CYP1A2三维结构中的位置信息等。

表8-7 CYP1A2常见的氨基酸突变信息及其对CYP1A2酶活性的影响

从表8-7中可以看出能够引起CYP1A2酶活性改变的氨基酸不需要一定位于蛋白内部的酶活性中心区域内，一些位于蛋白表面而远离活性中心的氨基酸突变同样也会对酶活性产生明显的影响。这些表面氨基酸可能位于连接蛋白表面和内部活性中心的分子通道周围，通过调节这些分子通道开放和闭合而改变酶催化底物的能力。此外，位于这种蛋白表面的氨基酸对蛋白活性的影响也可以看作是别构效应对于蛋白活性调节的一种表现。

随着对于蛋白结构和功能研究的不断深入，人们对于别构效应的作用方式和形式有了进一步的了解。目前普遍认为，除了纤维蛋白外，所有蛋白的活性都可以被别构效应所调节，同时该效应也被认为是通过蛋白结构中远程作用的调节方式而发挥作用，这使得别构效应在蛋白工程和药物设计中具有很大的应用前景。引起别构效应的远程作用可以由几种因素引发，如配体与蛋白之间的结合、氨基酸突变、蛋白功能基团的修饰等。其中氨基酸突变作为别构效应一个重要的始发因素，对于蛋白结构、构象和蛋白功能的作用一直是研究的热点。Acker将氨基酸突变之后引起的作用划分为三种不同的类型：局部作用、整体作用和特异的远程作用。而由突变引起的后两类作用又可以看作是特殊的别构效应调节方式。通过对几种常见的别构酶的研究发现，那些发生在距离酶活性中心较远部分的氨基酸突变可以改变蛋白局部甚至较大范围的运动方式，从而导致酶催化反应所要克服的能垒与野生型酶相比明显不同。

在本研究中，我们主要探讨针对CYP1A2的一个等位基因CYP1A2*11所引起的氨基酸突变（F186L）如何导致CYP1A2活性发生下降的作用机制，选择该突变有以下三个原因：

（1）实验证实，当CYP1A2中第186位氨基酸由苯丙氨酸突变为成亮氨酸后，可以明显降低CYP1A2的酶活性。从图8-11（a）中可以清楚看到，突变体F186L对两种特有的代谢底物7乙基香豆素（7-ethoxyresorufin）和非那西丁（Phenacetin）的去乙基化活性分别降低到CYP1A2野生型蛋白活性的28%和12.5%。但是比较突变蛋白和野生型蛋白之间的蛋白表达活性时却没有明显不同[见图8-11（b）]。因此，F186L氨基酸突变对于酶活性有直接作用，而对于蛋白表达活性没有影响。

图8-11 CYP1A2野生型、F186L突变体和其他突变体之间酶活性（a）和蛋白表达活性比较（b）*P＜0.05，**P＜0.01，与野生型比较

（2）根据CYP1A2的晶体结构，第186位的苯丙氨酸位于D螺旋和E螺旋之间的环状区域上，距离CYP1A2酶活性中心的距离约为26Å。这种位于蛋白表面的氨基酸突变而引起酶活性改变的现象与蛋白中通过别构效应来调节蛋白功能的作用形式非常类似。

（3）在CYP1A家族的蛋白多序列比对中，第186位氨基酸显示了高度的保守性，这表明了此氨基酸可能具有非常重要的功能。对于F186L在CYP1A2酶功能和结构作用的研究，可以帮助更好地理解表面氨基酸所具有的作用。

8.5.2 实验方法和步骤

8.5.2.1 对于CYP1A2野生型和突变体蛋白的分子动力学模拟

基于CYP1A2的晶体结构，我们分别构建CYP1A2野生型和F186L突变体蛋白的起始结构。由于在CYP1A2晶体结构中含有抑制剂分子，因此首先将删除抑制剂分子后的结构作为CYP1A2野生型的蛋白结构，然后，将野生型蛋白结构中的第186位苯丙氨酸的侧链改变成为亮氨酸的侧链，从而产生F186L突变体的蛋白结构。分子动力学模拟软件包AMBER和ff03分子力场用于两类蛋白分子的动力学模拟。

设置分子动力学模拟时，首先将蛋白分子溶于充满TIP3P水分子的正方体盒子中，保证蛋白质最外层的原子距离盒子的边缘为10Å；然后对整个系统进行能量最小化，包括500步的最陡下降能量优化和1500步的共轭梯度能量优化；能量优化后将整个体系的温度上升到298K，并在NVT系综水平上进行平衡；最后将整个体系在等温等压系综中进行20ns的分子动力学模拟。在分子模拟的过程中，采用SHAKE算法限制与氢原子相连的化学键的键长，用PEW方法处理静电相互作用。此外，积分时间步长设置为2fs。当整个体系达到平衡后，余下的分子动力学轨迹用于进一步的数据分析。

8.5.2.2 对于蛋白整体结构的分析

从模拟的起始结构作为参考结构，计算CYP1A2野生型和F186L突变体上所有骨架原子的RMSD值，用于描述野生型和F186L突变体结构在分子模拟过程中的变化程度。此外，通过计算CYP1A2野生型和F186L突变体结构中每个残基α碳原子的均方差波动（RMSF），比较每个结构中不同部分之间的波动变化。同时，利用二级结构分析软件DSSP分析从分子轨迹中提取的野生型和F186L突变体平均结构的二级结构改变情况。

8.5.2.3 利用主成分分析方法对蛋白运动的分析

将模拟产生的CYP1A2野生型和F186L突变体的动力学轨迹进行主成分分析，比较其蛋白运动方式的差异。在本研究中我们利用分子动力学模拟软件包AMBER中的ptraj模块对分子动力学轨迹中所有非氢原子进行主成分分析。在做分析之前，将从分子动力学轨迹中提取的所有分子构象以CYP1A2的晶体结构为参考结构进行叠合，从而移除分子模拟过程中产生的蛋白分子的平移和旋转运动。

通过对原子坐标的协方差矩阵进行主成分分析，得到本征向量及相应的本征值后，将原始的分子动力学轨迹投射到主要的本征向量中，从而可以观察该本征向量主要代表的蛋白运动方式。详细的运动方式可以用interactiv eessential dynamics进行分析，利用分子显示软件VMD进行显示。

8.5.2.4 CYP1A2活性中心的分析

为了便于对CYP1A2野生型和F186L突变体的活性中心进行比较，测量以下三种指标。①酶活性中心的几何维度：由于CYP1A2的活性中心可以近似看成扁平形的长方体，因此组成CYP1A2活性中心氨基酸之间的距离可以当作是活性中心的长、宽和高，通过比较这些距离的大小，来描述活性中心的变化。②活性中心周围氨基酸残基的溶剂可触及表面积（SASA）：由于CYP1A2的活性中心是位于蛋白内部的一个疏水性中心，因此围成活性中心的氨基酸残基的SASA的变化可以间接反映活性中心的暴露程度。氨基酸的SASA可以通过软件Naccess计算求出。③活性中心的溶剂可接触容积：该容积的大小通过软件Pocket计算。由于活性中心存在血红素辅基，在计算活性中心容积时应减去血红素体积（大约200Å3）。

8.5.2.5 CYP1A2蛋白结构中底物通道分析

利用分析蛋白结构中潜在通道的分析软件CAVER，对CYP1A2野生型和F186L突变体结构中的分子通道进行分析比较。从20ns的分子轨迹中每间隔1ns提取一个独立构象连同模拟前的分子构象，每个结构中总共有21个分子构象进行通道分析。在CAVER分析前首先要规定初始点的位置以及格点间距。本研究中我们将初始点设置在酶活性中心中血红素辅基上方的4Å位置处，格点之间的间距设置为0.8Å。对于每一个构象共选择分析20个通道，其中半径＞1.4Å的通道被认为是可能的分子通道。所有检测到的分子通道命名全部按照Wade小组提出的对于细胞色素P450酶中底物通道的命名方法。分子显示软件Py Mol用于显示所有检测到的分子通道在蛋白结构中的位置。

8.5.2.6 小分子化合物与CYP1A2野生型和F186L突变体的结合构象

分子对接软件Autodock4.0用于预测小分子与CYP1A2野生型和F186L突变体的结合构象。在本研究中共有3个小分子用于与CYP1A2野生型和F186L突变体进行分子对接，包括实验中测定CYP1A2酶活性的7乙基香豆素和非那西丁以及CYP1A2晶体结构中的抑制剂萘黄酮，它们的结构及重要的原子标号如图8-12所示。

图8-12 用于分子对接研究的3个化合物的分子结构

在分子对接时，首先将3个小分子的3D结构用软件SAMM构建，然后在MMFF分子力场中进行能量优化。能量优化后得到的结构将用于下一步的分子对接。由于常规的分子对接方法只考虑到配体小分子的构象变化而忽略蛋白分子的构象改变，因此为了更加全面地考虑蛋白分子的构象改变对分子对接结果的影响，我们采取了总体采样的对接方法进行分子对接。这种方法是利用分子模拟的方法，从得到的轨迹中提取多个蛋白构象与同一个小分子进行对接，最后对于分子对接结果进行统一分析处理。在本次实验中，我们间隔1ns从分子轨迹中提取10个不同的蛋白构象进行分子对接。

分子对接的具体参数如下：小分子被放置到蛋白活性中心边长为60Å的正方体之中，然后利用拉马克遗传算法对小分子在该正方体中的结合构象进行筛选。在每次对接计算中，拉马克遗传算法共运行100次，产生100个合理的小分子在蛋白中的结合构象。最后对产生的对接结果进行聚类分析，将产生的分子构象与最低能量的构象进行叠合，两个均方差值小于2Å的分子构象将被分成一类。

8.5.2.7 CYP1A2的多序列比对

利用多序列比对软件Cluster X对总共22个来自不同种属的CYP1A1和CYP1A2蛋白序列进行多序列比对。这些参与比对的蛋白序列与人CYP1A2序列相比，序列相似性介于48%～78%。所有序列都是从数据库Uni Prok KB中获得，并且多序列比对的结果用ESPript工具进行显示和标注。

8.5.3 结果和讨论

本次实验中对于CYP1A2野生型和F186L突变体蛋白进行20ns的分子动力学模拟，通过比较两者在蛋白结构和蛋白运动方式的不同，研究位于第186位氨基酸突变对于CYP1A2结构和功能的作用。在图8-13中显示了整个20ns分子动力学过程中野生型和F186L突变体蛋白与初始结构相比骨架原子的RMSD值变化。

图8-13 20ns分子动力学模拟过程中，野生型和F186L突变体蛋白骨架原子的RMSD值变化

从图8-13中可以发现，在模拟的开始阶段两个蛋白中的骨架原子波动的RMSD值较大，但当10ns之后波动逐渐稳定在2Å附近，表明整个模拟已经处于平衡状态。因此，本研究中所有对分子模拟轨迹的分析都是在10ns之后的轨迹上进行。

8.5.3.1 蛋白整体结构分析

首先，我们比较CYP1A2野生型和F186L突变体蛋白的整体结构，确定是否氨基酸突变会引起CYP1A2蛋白结构发生改变。从最后10ns分子轨迹中提取的野生型和F186L突变体蛋白的平均结构与CYP1A2晶体结构进行叠合。图8-14显示了叠合后的结果，可以发现三者的结构没有明显区别。此外，表8-8中显示了组成野生型和突变体蛋白主要二级结构的各个氨基酸组成。同样从该表中也可以看出，对于CYP1A2野生型和F186L突变型平均结构中的主要二级结构的氨基酸组成也没有明显不同。据此可以确定位于表面的F186L氨基酸突变并未影响蛋白整体结构。

同时我们也对三个结构中第186位氨基酸周围局部化学环境进行比较，发现在三个结构中几乎所有与第186位氨基酸有关的作用（包括疏水作用和氢键相互作用）都相同，唯一不同的作用是在CYP1A2晶体结构和野生型蛋白结构中第186位的苯丙氨酸与第481位的苯丙氨酸之间存在π π相互作用。而在F186L突变体结构中，由于苯丙氨酸被亮氨酸所替代，与第481位的苯丙氨酸的π π相互作用也就消失（见表8-9）。

图8-14 从10～20ns轨迹中提取野生型（紫色）和F186L突变体（黄色）的平均结构和CYP1A2晶体结构（灰色）结构叠合结果，其中标出每个结构中的主要二级结构部分（彩图见第393页）

此外，我们也分别从野生型和F186L突变型的最后10ns分子轨迹中各提取10个构象与CYP1A2晶体结构进行结构叠合，计算相应的RMSD值，结果如表8-10所示。从表中可以看出野生型蛋白构象与晶体结构相比显示出较小的RMSD值变化（平均值为1.9Å），而F186L突变蛋白与晶体结构相比有较大的RMSD波动（平均值为2.4Å）。综合以上分析可以得出：虽然F186L氨基酸突变没有改变CYP1A2的整体结构，但却明显使得突变蛋白结构的活动性增加。

表8-8 野生型和F186L突变型蛋白平均结构中主要二级结构的氨基酸组成

表8-9 CYP1A2晶体结构、野生型结构（11ns）和F186L突变型结构（11ns）中第186位氨基酸周围局部环境的比较

表8-10 从最后10ns分子轨迹中提取蛋白构象与CYP1A2晶体结构的RMSD值比较

以上结果表明，F186L氨基酸突变可以引起CYP1A2蛋白的整体结构活动性增强，为了能够确定在CYP1A2中哪些具体结构区域的活动性发生变化，比较了最后10ns模拟过程中CYP1A2野生型和F186L突变型结构中每个残基α 碳原子的RMSF值（见图8-15）。图8-15中的曲线表明，就整体蛋白结构而言，野生型和F186L突变型的结构波动变化非常相似，但在某些局部区域两者有明显的差别。例如：野生型结构中C D环区的波动要大于相应F186L突变型的C D环区，而在F186L突变型结构中的D 螺旋C 末端、D E环区、E F环区及G′G和G H环区的活动性要高于野生型的相应区域。依据RMSF比较可以清晰地确定在突变型中具有较大RMSF值区域的局部活动可能导致F186L突变型具有较大的RMSD值，接下来的蛋白运动分析将主要集中在以上这些RMSF值较大的区域。

通过以上结构分析和比较，确定F186L氨基酸突变没有引起蛋白结构的明显改变。由于在野生型蛋白中存在第186位苯丙氨酸与第481位苯丙氨酸之间的π π相互作用，使得野生型蛋白结构处于相对比较稳定的状态。但是当苯丙氨酸变成亮氨酸后，这种稳定蛋白结构的π π相互作用将消失，导致突变体结构的局部区域活动性增强。下面将对野生型和突变型蛋白运动形式的变化进行详细分析。

8.5.3.2 野生型和F186L突变蛋白之间蛋白运动方式的比较

主成分分析方法经常用于对从实验测定或模拟得到的大分子构象中与重要功能相关的蛋白运动。在本实验中，对于野生型和F186L突变型的最后10ns分子轨迹进行主成分分析，发现了其蛋白运动的主要差别。

表8-11显示了从野生型和突变型的分子模拟轨迹的主成分分析所获得的前10个本征向量及相应的本征值。结果显示基于前两个本征向量的信息，我们可以解释在所有蛋白运动变化中的50%以上的运动变化。而其他八个本征向量所含有的信息较少，并且通过观察它们所代表的野生型和F186L突变型的蛋白运动方式基本相似，因此我们主要比较前两个本征向量所代表的野生型和F186L突变型的蛋白运动差别。

表8-11 最后10ns野生型和F186L突变型分子轨迹的主成分分析得到的本征向量和本征值

利用IED软件，将野生型和F186L突变型的分子运动轨迹分别投射到主成分分析中所得到的前两个本征向量上。就整体蛋白运动而言，在野生型和F186L突变体结构中变化幅度较大的蛋白运动主要发生在两个螺旋之间的环区和蛋白表面的区域中，这些运动方式与基于正模分析所得到的蛋白亚结构域的低频运动方式类似。此外，通过对局部区域的蛋白运动比较，特别是在最后5ns的分子模拟轨迹中，发现在野生型和F186L突变体结构中存在着三种明显不同的蛋白运动方式。下面将对这三种不同的蛋白运动方式进行详细描述。

1）存在于F186L突变体结构中类似于书打开闭合的蛋白运动方式

首先在F186L突变体结构中观察到一种类似于书打开闭合的蛋白运动（见图8-16）。在这个运动形式中，F186L突变体结构中的D螺旋和F、G和H螺旋分别向中间的E螺旋靠近和远离，我们可以将E螺旋看作是一本书的中轴，而D螺旋和D E环看作是书的前页，E F环、F、G、G H环和H螺旋看成是书的后页，这两部分向着E螺旋靠近的运动相当于书合拢，与此相反的运动相当于书打开。在CYP1A2野生型蛋白结构的相应区域中没有发现与此相类似的蛋白运动方式。另外，在F186L突变体结构中参与蛋白运动的区域与具有较大RMSF的区域相一致。

为了在分子动力学轨迹中也能观察到这种特殊的蛋白运动方式，测量了最后10ns模拟轨迹中相应各螺旋之间的距离变化（见图8-17）。从结果中可以看出在野生型蛋白结构中各个螺旋之间的距离在模拟过程中没有明显变化，这与利用IED观察到的蛋白运动结果相一致。而在F186L突变体结构的模拟过程中，相应各螺旋之间的距离发生了明显的变化。在从13～17ns之间的模拟过程中，D螺旋与E螺旋之间、D螺旋与F螺旋之间的距离相对于野生型明显增大，这与上面描述的书被打开的蛋白运动变化相一致，此时突变体结构为一个相对打开的构象，而在模拟时间为17ns之后，几个螺旋之间的距离开始减小，这与上面描述的书合拢的蛋白运动变化相对应，突变体结构将从一个打开的构象转变成关闭的构象。

图8-16 野生型（a）和F186L突变型（b）第一种蛋白运动方式的比较（彩图见第393页）

黑色箭头指示着螺旋的运动方向。为了便于分辨蛋白运动的位置变化，将位于蛋白运动两个极端的构象进行叠合，其中一个构象的蛋白结构用正常模式显示，而另一构象的结构用阴影模式显示。

图8-17 野生型和F186L突变型在最后10ns分子轨迹中各螺旋之间的距离变化

2）F186L突变体结构中G′螺旋的收缩伸展运动

另外，我们在F186L突变体结构中还观察到在G′螺旋区域附近有关的收缩伸展运动（如图8-18）。但是在野生型蛋白结构中，G′螺旋区域相似的伸缩活动没有被发现。同样我们也测量了在模拟过程中位于G′螺旋两端氨基酸之间的距离变化（见图8-19）。从图中我们可以发现在野生型结构中G′螺旋两端氨基酸之间的距离基本没有改变，而在F186L突变体结构中G′螺旋两端氨基酸之间的距离度发生明显波动，特别是在16ns之后，距离波动变得更加显著。

图8-18 野生型（a）和F186L突变型（b）第二种蛋白运动方式的比较（彩图见第394页）

黑色箭头指示着G′螺旋的运动趋势。为了便于分辨蛋白运动的位置变化，位于蛋白运动两个极端构象被叠合，其中一个构象结构用正常模式显示，而另一构象结构用阴影模式显示。

图8-19 最后10ns分子轨迹中在野生型和F186L突变型结构中G′螺旋区域的末端氨基酸之间的距离变化

3）野生型蛋白结构中C D环区的上下摇摆运动

除了以上在F186L突变体结构中发现的两种不同的蛋白运动方式外，在野生型蛋白结构中还观察到了C D环区的上下摇摆运动，如图8-20中箭头所示。而在F186L突变体蛋白结构中C D环区没有发现相应的蛋白运动形式。该结果与RMSF得到的结果相一致。

通过利用主成分分析方法对分子运动轨迹进行简化分析，发现F186L氨基酸突变可以使蛋白结构中D螺旋、D E环和E F环几个区域的蛋白运动性增强。由于第186位苯丙氨酸位于D E环区内，更靠近E螺旋，并且在苯丙氨酸侧链上具有一个苯环结构，它将会与481位的苯丙氨酸形成π π相互作用，限制D螺旋和D E环状区域附近的蛋白活动，使蛋白结构保持在一个相对稳定的状态。而当第186位苯丙氨酸变成亮氨酸后，由于亮氨酸侧链上具有相对较小且灵活的基团，同时亮氨酸与第486位的苯丙氨酸也不会形成π π相互作用，因此将导致以上几个区域的蛋白活动性增强。

根据以上基于蛋白结构和运动方式的比较，可以明确F186L氨基酸突变将不会对CYP1A2蛋白的整体结构产生显著影响，但可以增加D、E和F螺旋区域的蛋白柔韧性。因此，根据以上分析结果，对于第186位氨基酸由苯丙氨酸突变成亮氨酸后导致CYP1A2酶活性降低的实验现象提出两个可能的机制。第一，由于突变体结构中一些结构区域活动性增强而导致酶活性中心的大小、形状发生相应变化，从而不利于底物与之结合，导致代谢底物的能力降低；第二，由于突变体结构的活动性增强，导致CYP1A2上存在的底物通道发生变化，影响底物分子正常进入酶活性中心。为了便于描述，我们称第一种机制为活性中心改变机制，第二种机制为底物通道改变机制。下面将对这两种机制的可能性进行详细分析。

图8-20 野生型（a）和F186L突变型（b）中第三种蛋白运动方式的比较（彩图见第394页）

黑色箭头表示C D环区的运动方式。为了便于分辨蛋白运动的位置改变，将位于蛋白运动的两个极端构象结构进行叠合，其中一个构象结构用正常模式显示，另一个构象的结构用阴影模式显示。

8.5.3.3 第一种机制——活性中心改变机制

图8-21 代表CYP1A2活性中心的长、宽和高的氨基酸在活性中心的位置（彩图见第394页）

由于CYP1A2的活性中心的形状近似于长方体，可以通过比较活性中心长、宽和高的改变来描述活性中心的大小变化。从组成活性中心的氨基酸残基之间的距离中选择3个近似垂直的距离来表示活性中心的长、宽和高。如：第312位天冬酰胺中α碳原子与497位亮氨酸中α碳原子之间的距离可近似看作活性中心的长度；第122位丝氨酸中α碳原子与316位甘氨酸中α碳原子之间的距离看作是活性中心的宽度；第117位异亮氨酸中α碳原子与位于活性中心的血红素辅基上的铁原子之间的距离看作是活性中心的高。以上这些氨基酸在活性中心的位置如图8-21所示。此外，对于CYP1A2晶体结构、野生型和F186L突变型平均结构之间的活性中心比较的结果如表8-12所示；在不同构象的野生型和F186L突变型结构中围成活性中心的主要残基的SASA比较结果如图8-22所示；在不同构象的野生型和F186L突变体结构中活性中心的体积比较结果如表8-13所示。

从表8-12中可以看出F186L突变体平均结构中活性中心的长度明显小于野生型平均结构和CYP1A2晶体结构的；从图8-22中也发现，在突变体结构中围成活性中心的主要氨基酸SASA与野生型结构的相比明显减小；此外，表8-13中的结果表明在突变体结构的活性中心的容积大约是野生型结构中活性中心容积的一半。以上这些对于野生型和突变体活性中心的比较结果说明：与野生型结构相比，F186L突变体结构的活性中心的体积减小，不易使水溶液进入及与底物分子的结合。这将导致蛋白和底物小分子的亲和力降低，从而引起代谢底物的能力下降。

表8-12 CYP1A2晶体结构、野生型和F186L突变型平均结构间活性中心大小比较（单位：Å）

图8-22 野生型和F186L突变体结构中围成活性中心的主要残基的SASA的比较

最后10ns的分子轨迹中，每纳秒提取1个构象，基于这10个构象计算平均值和标准差，此外底物通道的名称也标记在相应残基上。

表8-13 最后10ns分子轨迹中提取的野生型和F186L突变体结构中活性中心的溶液可及容积比较（单位：Å3）

因此，比较野生型结构和F186L突变体结构的活性中心大小和容积可以得出以下结论：基于第一种活性中心改变机制可以合理解释为什么突变体代谢底物能力下降，但是同时突变体结构的活性中心的溶液可及容积的降低可能是由于连接于蛋白表面和活性中心之间的底物通道关闭所导致的。由于Redberg的研究表明利用计算方法很难准确将活性中心的边界和底物通道分开，因此下面将对于第二种底物通道改变机制进行分析。

8.5.3.4 第二种机制——底物通道改变机制

通过对整个分了模拟过程中蛋白结构中的底物通道进行分析，观察存在于蛋白结构中的底物通道打开和关闭的过程，以及与蛋白运动之间的关系。由于在细胞色素P450酶家族中的酶蛋白结构具有高度的相似性和保守性，因此我们对CYP1A2中不同底物通道的命名原则参照Wade小组从52个细胞色素P450酶结构中归纳的底物通道命名方法。各个底物通道的名称及其位置的详细信息如表8-14所示。

从野生型和F186L突变型的20ns的分子模拟轨迹中间隔1ns提取20个不同蛋白构象，对这些蛋白构象中的底物通道进行进一步分析，表8-15和表8-16分别显示了对于野生型和突变型不同构象中相应的通道分析结果。

从表8-15和表8-16中可以看出，在模拟的初始阶段，只有较少的底物通道被检测到，这时蛋白结构处于一个相对关闭的状态。这里我们描述CYP1A2处于开放或关闭状态主要依据底物通道开放的状态。当蛋白处于开放状态时，从结构中可以检测到较多的底物通道与CYP1A2酶活性中心相连，这样可以保证底物顺利进入CYP1A2酶活性中心，从而保证酶催化反应顺利发生；与此相反，如果说明蛋白处于关闭状态，则较少的底物通道处于开放状态，底物将不能正常进入酶活性中心，酶催化的反应也较难发生。由于野生型和F186L突变体模拟的起始结构都是从CYP1A2晶体结构中产生，因此可以推断在晶体结构中有抑制剂分子结合在酶活性中心，而可能导致CYP1A2结构处于一个相对关闭状态。最近，通过实验在CYPcam结构中也观察到了相同的变化过程，当有底物小分子结合到酶活性中心时，所测定的CYPcam的结构处于关闭状态，而当没有相应底物结合时，所得到的CYPcam结构为开放构象。

表8-14 Wade小组对于细胞色素P450酶通道的命名方法

随着模拟的进行，从两个结构中所检测到的分子通道数目开始增多，这表明蛋白开始从闭合构象转变为开放构象。分析过程中，如果在总共21个蛋白结构中有50%以上的结构可以检测到的分子通道认为是存在的主要通道。因此，对于野生型和F186L突变型结构的主要通道信息显示在表8-17，它们在蛋白结构中的位置显示在图8-23中。

从表8-17中可以确定底物通道1、2a、2b、2e、2f、5、水通道和溶剂通道8个底物通道是野生型结构中主要检测到的底物通道，它们在野生型结构中的位置显示在图8-23（a）中。在这几个通道中，溶剂通道已经被认为在细胞色素P450酶结构中最主要的底物进入活性中心和产物排出通道。这可能是因为相比于其他底物通道，该通道在连接蛋白表面和酶活性中心的距离最短，并且相关的计算研究也表明通过该通道可以使底物分子直接结合在血红素辅基的第6个配体结合处，更有利于催化反应的发生。

表8-15 野生型蛋白结构中底物通道分析结果

注：黑色方块表示在相应结构中检测到了该通道存在，而白色方块表示没有检测到通道。

表8-16 F186L突变型结构中底物通道分析结果

注：黑色方块表示在相应结构中检测到了该通道的存在，而白色方块表示没有检测到通道。

表8-17 20ns分子模拟过程中对于野生型和F186L突变型结构检测到的底物通道

注：用粗字体显示的为该结构中主要的底物通道。

图8-23 野生型（a）和F186L突变型（b）结构中主要底物通道的位置（彩图见第395页）

对于F186L突变型结构而言，在野生型结构中发现的大多数通道都处于开放状态，除了通道2f和溶剂通道只是暂时处于开放状态。这些结果表明相对于野生型结构，F186L突变体结构处于相对闭合状态。此外，图8-22显示F186L突变体结构中那些溶液可触及表面积降低的残基大多位于通道2f和溶剂通道附近。这个结果也间接证明了上述提到的“活性中心改变的机制”或许与“通道改变机制”密切相关的假设。

下面我们将把蛋白结构通道分析结果与主成分分析得到的蛋白运动结果相结合，来研究通道开放与蛋白运动之间的关系。从主成分分析中发现由于氨基酸突变可以导致突变体结构的几个区域，如D、E和F螺旋的活动增强。同时在通道分析的结果中发现，这些活动增强区域的氨基酸残基大多参与了溶剂通道的组成，因此发生在D、E和F螺旋区域的运动可以导致溶剂通道开放和关闭。依据溶剂通道打开和关闭的状态，也可以将突变体结构分成相应的开放和闭合两类构象。此外，在突变体结构中通道2f大部分时间也处于关闭状态。这主要是由于F、G和G′螺旋上的氨基酸组成了该通道，发生在F186L突变体中G′螺旋的收缩展开运动引起了该通道的打开和关闭。根据以上的分析表明，通过从主成分分析提到的蛋白运动结果可以很好地解释溶剂通道和通道2f的打开和关闭。

此外，在实验测定CYP1A2酶活性的结果表明，F186L氨基酸突变虽然可以明显降低酶的活性但并没有引起酶活性完全丧失。根据以上得到的通道分析结果，认为当溶剂通道关闭时，底物分子还可以通过其他分子通道进入活性中心。同时，由于F186L突变体结构中存在着开放和闭合两类构象，因此F186L突变体所具有的代谢底物活性或许与该结构的开放状态持续时间相关。表8-17中显示在分子动力学模拟过程中，F186L突变体结构的溶剂通道开放的时间百分比为29%，这与实验中测定突变体相比于野生型对7 乙基香豆素的去乙酰化活性为28%和对非那西丁的代谢活性为12.5%处在相似的范围内。因此，通过以上分析表明第二种通道改变机制可以更加合理地解释F186L突变体酶活性改变的机制。

图8-24 对于CYP1A2的酶活性有明显影响的氨基酸相对于主要底物通道的位置（彩图见第395页）

为了更加详细说明底物通道在维持酶活性中的重要性，将表8-7中列举的对于CYP1A2酶活性有重要影响的突变氨基酸相和主要底物通道的位置一起显示到图8-24中。发现除了348位的天冬氨酸外其他的氨基酸都位于底物通道附近，这也间接证实了我们检测的底物通道的合理性和准确性。

8.5.3.5 野生型和F186L突变型蛋白与小分子结合构象比较

利用分子对接和分子模拟的方法，采用总体采样的策略预测小分子与野生型和F186L突变型蛋白结合的构象。将所有得到的小分子在蛋白结构中的结合构象分成三组：第一组中所有小分子可以正常结合在酶活性中心，并且代谢位点面向血红素辅基中的铁原子，两者之间的距离小于6Å；第二组中小分子也可以结合到酶活性中心，但相应的代谢位点远离血红素辅基中的铁原子；第三组中小分子结合到酶活性中心以外。

首先，将α萘黄酮分子与野生型蛋白进行分子对接，将结果与CYP1A2晶体结构进行比较，从而对使用分子对接方法的准确性做出评价。结果发现，所有α 萘黄酮分子与野生型蛋白的结合构象全部分布在前两组中，其中第一组中α 萘黄酮分子的第4位碳原子与血红素的铁原子相对，该构象与晶体结构中的α 萘黄酮分子结合的构象一致；而在第二组中α萘黄酮分子的第5位和第6位碳原子与血红素中的铁原子相对，虽然该结合构象与晶体结构中的α 萘黄酮分子的结合构象不同，但与相关实验证实的这两个位点通常也是α 萘黄酮分子代谢位置的结论相一致。以上结果直接表明，我们使用的这种分子对接方法可以准确预测小分子与蛋白的结合构象。

对于7乙基香豆素和非那西丁2个小分子的对接结果如表8-18所示。从结果中可见在野生型结构中，2个小分子的对接结果都分布在前两组中，即在所有得到的构象中，2个小分子都结合到酶活性中心。而在F186L突变体结构的对接结果中，除了分布在前两组外，在一些结合构象中小分子结合到酶活性中心之外。

此外，继续把酶活性中心外的小分子结合构象按照位置分成三簇。图8-25显示在这些结合到酶活性中心之外的小分子主要位于通道2a、2b、2e、2f和溶剂通道附近。这个结果也间接表明了我们检测到的底物通道的合理性。

表8-18 7乙基香豆素和非那西丁在野生型和F186L突变型结构中的对接结果

8.5.3.6 CYP1A家族蛋白之间的多序列比对及芳香氨基酸在CYP1A2中的作用

将CYP1A家族中来自15个不同种属的22个蛋白序列进行比对，以此确定在序列中比较保守的氨基酸残基。蛋白多序列比对的结果显示在图8-26（a）～（h）中。

图8-25 位于酶活性中心外的结合小分子相对于底物通道的位置（彩图见第395页）

（a）正视图；（b）侧视图

图8-26 CYP1A家族中15个不同种属的22个蛋白的序列比对（彩图见第396～398页）

在CYP1A家族蛋白多序列比对中，属于100%保守残基在蛋白二级结构的分布如表8-19所示。共有100个保守残基被鉴定，其中41%分布在α螺旋内，41%分布在α螺旋之间的环区域。由于CYP1A2蛋白序列总长度约为500个氨基酸，因此100%保守氨基酸占了CYP1A2所有氨基酸的20%。

表8-19 多序列比对中保守氨基酸在蛋白结构中的分布[n（%）]

图8-27 多序列比对中100%保守的芳香氨基酸与CYP1A2主要的底物通道的相对位置（彩图见第399页）

由于α螺旋之间的环区域中氨基酸对于保持蛋白活动的柔韧性和蛋白构象的稳定性具有重要作用。此外，已确定的细胞色素P450酶中的大多数底物通道都是位于环区域附近，因此，位于环区域的氨基酸的保守性可以保证细胞色素P450酶结构中的底物通道的存在。此外，从图8-27中可以发现第186位氨基酸和第481位氨基酸都属于非常保守的氨基酸，这也间接表明它们之间的π π相互作用对于CYP1A2的重要性。

此外，在表8-19中列出的15个100%保守的具有苯环的氨基酸中，有5个是组成底物通道的残基，其他10个氨基酸位于底物通道的附近。这些保守的芳香氨基酸与底物通道的相对位置显示在图8-27。由于CYP1A家族的蛋白酶通常代谢具有多环的小分子化合物，因此可以认为位于底物通道附近具有苯环的保守残基，会通过π π相互作用来识别底物小分子，并且帮助小分子沿着底物通道进入酶活性中心。同时在其他的细胞色素P450酶，例如CYP119中，芳香族氨基酸已经被认为是维持酶结构完整的必需结构成分。

8.5.4 结论

在本研究中我们利用分子动力学模拟、分子对接及其他与结构相关的方法对于表面氨基酸突变在CYP1A2结构和功能中的作用进行研究探讨。由于缺少了186位苯丙氨酸与481位苯丙氨酸之间的π π相互作用，导致突变体蛋白结构的活动性增加，表现为蛋白中的D、E和F螺旋出现类似于书的打开合拢运动。而该区域恰恰是主要的底物通道区域，蛋白运动引起了主要的底物通道的开放和关闭，继而影响酶代谢底物的能力。同时我们的结果也表明，这种类似于别构效应由远离活性中心的氨基酸突变对酶活性进行调节的主要方式，是通过改变蛋白结构柔韧性和改变蛋白所处的构象介导完成的，该结论也与最近关于别构效应介导形式的研究结果相一致。