底物浓度对酶促反应速率的影响

（一）底物浓度曲线

在酶浓度、温度、pH及其他反应条件恒定的前提下，底物浓度（［S］）的变化影响酶促反应速率（V），V对［S］作图呈矩形双曲线（图2－9）。

（1）当［S］较低时，酶还未被底物饱和，V与［S］成正比例，酶促反应呈一级反应，随［S］的增加而上升，此时的反应速率称为酶促反应初速率（initial velocity，V0）。

（2）随着［S］的进一步增加，V不再成正比例升高，酶促反应表现为一级与零级的混合级反应，V的增幅不断下降。

（3）［S］不断增大，将所有酶的活性中心饱和之后，V不再增加，酶促反应表现为零级反应，V无限接近最大反应速率（maximum velocity，Vmax）。

图2－9 底物浓度对酶促反应速率的影响

（二）米－曼氏方程

中间产物学说是解释酶促反应中底物浓度与反应速率之间关系的基础。1913年， L．Michaelis和M．Menten经过大量的研究，在中间产物学说的基础上，推导出著名的米－曼氏方程（Michaelis－Menten equation），简称米氏方程（Michaelis equation）。

［S］为底物浓度；Vmax为最大反应速率；V为不同底物浓度时的反应速率；Km为米氏常数（Michaelis constant），是酶的特征常数之一。

当底物浓度很低，即［S］≪Km时，V＝［S］，反应速率V与底物浓度［S］成正比；当底物浓度很高，即［S］≫Km时，V≌Vmax，反应速率达到最大反应速率，酶全部被底物饱和，再增加底物浓度也不能影响反应速率。

米氏方程的推导基于以下假设：

（1）酶促反应是单底物反应；

（2）测定的反应速率是初速率V0，此时生成的产物量极少，逆反应可忽略不计；

（3）底物浓度［S］超过酶浓度［E］，在测定反应初速率的过程中［S］的变化可忽略。

米氏方程的推导如下：

酶促反应体系中的酶有两种存在形式：游离酶和与中间产物结合的酶。游离酶浓度为酶总浓度减去结合到中间产物上的酶，即［游离酶］＝［E］－［ES］。

当反应系统处于稳态时，ES的生成速率＝ES的分解速率，即：

k1（［Et］－［ES］）［S］＝k2［ES］＋k3［ES］

整理上式得：

令Km＝1代入上式并整理得：［ES］＝

因为单位时间内产物P的生成量代表了酶促反应速率，所以

当底物浓度很高时，所有的酶均与底物生成ES，此时［E］＝［ES］，反应达到最大速率。

即Vmax＝k3［ES］＝k3［E］，将其代入上式，则得米氏方程：

（三）Km及Vmax的意义

1．Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度 当酶促反应速率达到最大反应速率的一半时，米氏方程变换为：

经整理得：Km＝［S］

2．Km值表示酶对底物的亲和力 由米氏常数的推导过程已知，Km＝3，当反应中间产物ES分解成E和S的速率远大于分解成E和P的速率，即k2≫k3时，k3可忽略不计。这时，

KS为ES的解离常数。

此时，Km值可以表示酶对底物的亲和力。Km值越小，表明酶促反应达到最大反应速率时所需的底物浓度越低，也表明酶对底物的亲和力越大。

注意：不满足k2≫k3时，Km不能表示酶对底物的亲和力。Km值和KS值的涵义不同，不能相互代替。

3．Km值是酶的特征常数之一 Km值只与酶的结构、底物及反应条件（如温度、离子强度、pH等）有关，与酶的浓度无关。不同的酶有不同的Km值，范围很广，在10－6～10－2mol/L之间。作用于同一底物的不同酶有不同的Km值，作用于多种底物的酶对其不同底物也有不同的Km值。

4．酶被底物完全饱和时的反应速率定义为Vmax当酶促反应中的酶全部被底物饱和后，反应达到最大反应速率Vmax，即Vmax＝k3［Et］。酶浓度越高，酶促反应的Vmax越大。

5．酶的转换数 酶完全被底物饱和时，一个酶分子或酶活中心在单位时间内催化底物生成产物的分子数，称为酶的转换数（turnover number）。动力学常数k3用于描述酶的转换数， k3＝Vmax/［Et］。如果已知反应中酶的总浓度，就可以从Vmax计算出酶的转换数，单位为S－1。酶的转换数可用来表示酶的催化效率。对于生理性底物，酶的转换数大多在1～104S－1。

表2－6 某些酶的转换数

（四）作图法求取Km和Vmax值

1．林－贝作图法 最常用的直线作图法是林－贝（Lineweaver－Burk）作图法，又称为双倒数作图法（图2－10）。将米氏方程的两边同时取倒数，加以整理即得林－贝方程，它是一个直线方程：

1/V对1/［S］作图，横轴截距为－1/Km，纵轴截距为1/Vmax。

2．其他的作图法 林－贝方程的两边同时乘以［S］，即得Hanes方程（图2－11）：

图2－10 双倒数作图法

图2－11 Hanes作图法

林－贝方程的两边同时乘以Vmax，再经整理得Eadie－Hofstee方程：

各种直线作图法都有其特殊的优势，在进行酶促反应动力学的研究时，可以根据不同的需要选择不同的作图法。