底物浓度能影响酶的活性吗

（一）底物浓度与反应速度呈矩形双曲线

酶促反应中，在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下，反应速度与底物浓度的关系呈矩形双曲线（rectangular hyperbola）

（图4-10）。在酶促反应起始时阶段反应速度迅速增高呈直线上升，这种反应速度与底物浓度呈正比的反应为一级反应（a）。如底物浓度继续增加，所有的酶分子均被底物饱和，反应速度不再增加，此时反应速度与底物浓度的增加无关，反应为零级反应（c），曲线出现平坦。当反应体系中酶分子大部分与底物结合时，反应速度的增高则渐渐变缓，即反应的第二阶段为混合级反应（b）。

（二）米氏方程式

几乎所有的酶都有被底物饱和的现象，不同的酶达到饱和时所需要的底物浓度不尽相同。解释酶促反应中底物浓度和反应速度关系的最合理的学说是中间产物学说。该学说认为酶促反应形成酶-底物复合物（ES），即中间产物，然后此复合物再分解为产物和游离的酶。ES生成是酶促反应中十分重要的步骤，其与产物生成速度有关。凡是影响ES复合物生成的因素都可影响底物变成产物的速度，如[E]、[S]、温度、pH、激动剂、抑制剂等。

图4-10 底物浓度对酶促反应速度的影响

1913年Leonor Michaelis和Maud Menten经过了大量实验，提出了反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即著名的米－曼方程式，简称米氏方程式（Michaelis equation）。

方程式中Vmax为最大反应速度（maximum velocity），[S]为底物浓度，Km为米氏常数（Michaelis constant），V是不同[S]时的反应速度。当[S]很低时可忽略不计，即反应速度与底物浓度成正比，即一级反应部分（图4-10的a段）；当[S]很高时（[S]>>Km），Km可忽略不计，V≈Vmax；反应速度达最大速度，此时再增加[S]，反应速度也不再增加，为曲线的平坦段（图4-10的c段）。米氏方程式的推导以两个假设为前提：①稳态观念，当酶促反应趋于稳态时ES的生成速度与分解速度相等；②酶促反应中[S]>>[E]，因此[S]的变化在反应过程可忽略不计。反应式中K1、K2和K3分别为各反应的速度常数。鉴于反应过程中，不断有一部分E与S结合生成ES，且反应速度又取决于游离酶浓度。故游离酶浓度为总酶浓度[E]中减去生成ES中的酶浓度，即[游离酶＝[E]－[ES]，这样

当反应处于稳态时，ES生成速度＝ES分解速度，即

当[S]很高时，所有E与S生成ES中间产物，反应达最大反应速度，此时[E]＝[ES]，即将

（4-8）式代入（4-7）式，即得米氏方程式：

（三）Km和Vmax的意义

1．当米氏方程为，故Km＝[S]。这表示Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。

2一些酶的K>>K，即ES解离成E和S的速度明显超过分解成E和P 23（产物）的速度，K3可忽略不计，则即此时Km近似ES的解离常数Ks。在这种情况下Km可表示酶和底物的亲和力。Ks。Km愈小，酶和底物亲和力愈大，这表示不需要很高的底物浓度就可达到最大反应速度。但并非所有酶促反应中K3都远小于K2，所以Ks和Km含义不同。

3．Km是酶的特征性常数，它与酶结构，酶所催化的底物和反应环境如温度、pH、离子强度等有关，而与酶浓度无关。Km的单位是mmol/L，大多数酶的Km为10－6～10－2 mol/L，不同种类酶的Km不同。如一种酶有多个不同的底物，则酶对每一种底物各有特定的Km。

4．Vmax是酶被底物完全饱和时的反应速度。当[ES]＝[ET]时，即酶被底物完全饱和时，Vmax＝K3[ET]，如果知道酶的总浓度（ET）和Vmax，即可计算出酶的转换数（turnover number），当酶被底物完全饱和时，单位时间内每个酶分子（或活性中心）催化底物转变成产物的分子数。K3即为酶的转换数，大多数酶的转换数为10－4～1/s。

（四）Km和Vmax的测定

从图4-10中可知，由于底物浓度对反应速度影响呈矩形双曲线，因此难以从该图中准确测得Vmax和Km。如将米氏方程两侧取双倒数处理，得到下面方程式。

以1/V对1/[S]作图，可得直线图（图4-11），称林-贝双倒数作图或Lineweaver-Burk作图。直线在横轴上截距为–1/Km，纵轴上截距为1/Vmax，由此直线可较容易地求得Vmax和Km。此外，在上述倒数方程等式两边同时乘以[S]，得公式：[S]＝Km+1[S]。以[S]对[S]作图为VVmVmV Hanes作图法（图4-12），其横轴截距为–Km，直线斜率为1/Vmax。

图4-11　双倒数作图法

图4-12　Hanes作图法