细胞骨架是否参与细胞分化分裂

胚胎干细胞（ESCs）来自于胚胎囊胚的内细胞团或者胎儿的生殖嵴，是一个具有自我更新和多分化潜能的特定细胞群，属于三胚层全能干细胞。其基本特征：①分化潜能多，具有分化为机体任何组织细胞、器官的能力；②无限扩增的能力，即理论上在体外条件适宜的情况下，通过有丝分裂无限扩增，长久和稳定地自我复制；③可以长期保持未分化状态。ESCs的这些特征，使其成为人体器官功能丧失（特别是由于毛细胞缺失造成的耳聋）后替代治疗的理想选择。在胚胎发育的早期（受精后5～7d）即囊胚期阶段，出现了两种不同的细胞类型：包绕在外形成囊腔壁的外胚滋养层细胞，将来发育形成胎盘；位于囊腔内的内细胞团，将来发育形成胚胎。内细胞团经体外培养就成为ESCs。早在1981年，Evans等从鼠的囊胚中分离出内细胞团，成功建立了体外培养哺乳类ESCs的方法。ESCs已被用于帕金森、脊髓损伤、糖尿病动物模型的治疗，另发现其可以分化为有功能的小鼠精子，与卵子结合后孵育出存活的子代小鼠。理论上ESCs可以分化为体内任何一种细胞类型，因此将ESCs植入到受损的内耳替代内耳细胞，恢复其功能为广大感音神经性耳聋患者带来了希望。

（一）ESCs的分化

1．诱导分化　ESCs的多分化潜能使之可以在特定条件下被诱导分化为多种细胞。经典的诱导分化方法是模拟体内胚胎发育的过程，该方法必须先在体外将ESCs诱导成拟胚体（EBs），经悬浮培养和添加因子或基因促使其定向分化。早在1985年Doetschman等就通过在培养基中加入白血病抑制因子（LIF），抑制ESCs分化，后再去掉LIF，经悬浮培养使ESCs变成EBs。EBs是大球形的悬浮团，由内、中、外3个胚层组成。ESCs分化始于外胚层，在基因调控、蛋白表达方面与体内早期分化有许多相似之处，但是分化的精确时间存在差异。目前，ESCs已经在体外被诱导分化为多种细胞，如造血细胞、多巴胺能神经元、心肌细胞、生殖细胞、肝细胞、神经细胞、胰岛细胞、内皮细胞和成骨细胞等。

Pacacios等用胰蛋白酶将EBs消化成单个细胞后添加干细胞因子和血小板生成素，定向分化出造血干细胞。Rolletschek等用促生长因子IL－1B、脑源性神经生长因子（BDNF）、转化生长因子B3（TGF－B3）等作用，使ESCs分化成了TH阳性的多巴胺能神经元。Li等将鼠ESCs来源的EBs转移到含ES终止液的组织培养皿中，经过贴壁，加入因子EGF、IGF－1、bFGF来进一步分化，最终得到表达毛细胞特异性标记物的细胞。上述研究中，虽然ESCs向不同细胞诱导时所加的因子不同，但是各种促分化因子都是在EBs形成以后加入，可能各种促分化因子只能在胚体发育到一定阶段才能发挥作用。Yuasa等通过在EBs形成前加入Noggin预作用3d，结果EBs形成后中胚层细胞增加，由ESCs分化形成的心肌细胞数目增加了100倍。也有实验证明，ESCs可以不经历EBs阶段，而是以单克隆方式增殖分化。这种不经历EBs阶段的培养方式，被认为仅仅适用在成分明确的培养基中，培养特定的细胞系，可以解决细胞纯化问题。如果不加因子诱导，也不加LIF抑制分化过程，ESCs将会向什么方向发展呢？Hubner等将小鼠ESCs培养在生殖细胞专用的无饲养层的培养基上，没有经过任何处理获得了卵子，提示ESCs向卵子的分化可能是自然发生的过程。

研究表明，ESCs在体外培养条件下，可以在某些因子的诱导下分化为神经细胞。Matsumoto等发现，向ESCs添加PA6基质细胞，与新生小鼠听觉上皮共培养7d后可分化成表达TuJ1的类神经细胞。这些细胞具有神经突，向耳蜗内的毛细胞底外侧表面延伸。另外，ESCs在毛细胞附近表达突触囊泡蛋白，提示神经终端突触小泡的存在，有能力使这些新生神经元具有功能性。为研究ESCs与前庭上皮的相互作用，Kim等将新生小鼠前庭组织与ESCs共培养，结果显示ESCs进入前庭上皮并标记有TuJ1。为进一步界定这些细胞，他们用一种前庭神经节后突触标记物NR1进行标记，数据显示这些ESCs完全分化为各种需要的内耳神经细胞亚类。更重要的是，这些ESCs还表达谷氨酸－传入神经元感觉换能神经递质的标记物。

2．诱导分化的基因调节　ESCs诱导分化的本质是基因表达发生了变化，当它向不同的组织细胞分化时会有不同基因组合的表达变化。所有ESCs都表达Oct4、Nanog和Sox2转录因子，它们在维持ESCs自我复制和亚全能型中发挥重要作用。Oct4基因在ESCs中有丰富表达，ESCs分化一旦启动，其表达立刻下调。Sox2基因在未分化的ESCs中表达，而随着细胞分化而表达下调，也是内耳毛细胞形成的上游调节基因。Nanog基因在未分化的ESCs中大量表达，而在分化的细胞中未发现。有实验证明，在维持ESCs自我更新的过程中，Nanog是与Oct4平行的另一条分子途径。从Nanog基因持续表达的ESCs培养体系中撤除LIF后，ESCs形态无明显变化，Oct4基因表达水平维持正常。有关基因调控的细节问题及发挥作用的精确时间序列仍待进一步探索。

ESCs向不同组织细胞分化时也需要不同基因的参与。Kim等发现转录因子Nurr1的作用可促进ESCs分化为有功能的多巴胺神经元，分化率达50%。Pitx3为调节中脑多巴胺能神经元生成和维持的关键转录因子，Zhao等报道将Pitx3和GFP转染入鼠ESCs中，并与PA6细胞共培养，产生了更多的多巴胺能神经元。Ying等将绿色荧光蛋白敲进ESCs的Sox1区并用维A酸促进其分化，结果ESCs分化为带绿色的神经祖细胞，同时表达Sox1。在利用cDNA阵点技术分析细胞分化基因的调控机制研究中，人们发现大约有1　000个基因参与到ESCs向神经前体细胞的分化过程。可以想象如果利用转染或其他方法向干细胞中引入转录子或引发干细胞定向分化的活性基因，有望实现ESCs的定向分化，高效率、高纯度地获得目的细胞。

（二）ESCs向内耳细胞分化的体内研究

1．向毛细胞分化　利用体外和体内方法，Li等证实ESCs除可分化为神经元和胶质细胞，还可分化为毛细胞样细胞。ESCs 对EGF和bFGF的培养基起反应，发育成细胞集落，表达神经元前体细胞标记物，如nestin，Pax2，BMP7。细胞进一步分化，可表达Math1和myosinⅦA，或者Math1和Brn3。最后，将这些分化的细胞注入发育第16～17节的鸡胚内耳中。注射后16h，一些ESCs已经整合到宿主损伤区域的上皮中，其他细胞整合到支持上皮质。3d后，ESCs整合到上皮中，与周围鸡胚组织成熟毛细胞的形态相似。在囊斑的前庭上皮，注射的ESCs标记富含肌动蛋白的espin阳性毛细胞束。这些结果提示ESCs注射到发育的鸡胚内耳中，能够整合到上皮中并分化为毛细胞。但是，这些毛细胞是否具有功能还不确定。

ESCs定向分化是内因和外因共同作用的结果，其中外因起着重要作用。有学者认为，哺乳动物内耳毛细胞损伤后无法再生的原因是成熟内耳的前体细胞数量较少。为此，Li等先将ESCs在体外经EGF/IGF－1诱导分化为内耳前体细胞，再将前体细胞植入鸡胚听囊上皮，结果在耳蜗毛细胞层发育为表达毛细胞标记物MyosinⅦ的类毛细胞。该研究虽然并非在哺乳动物体内完成，但是为ESCs内耳植入治疗开辟了新的思路。Coleman等将带有EGFP的鼠源性ESCs通过圆窗直接注入鼓阶，检测部分分化的鼠ESCs，发现带有EGFP的mESCs可在鼓阶中存活4周时间，其中2周时数量最多。但是，国际文献中至今尚无将ESCs导入哺乳动物内耳后分化为耳蜗感觉毛细胞的相关报道。

2．向螺旋神经节细胞分化　在体研究显示，ESCs可以在宿主提供的微环境下进行分化、整合并具有功能的能力。将ESCs注入到蜗轴和听神经中，能够分化为功能性螺旋神经节细胞。Okano等将ESCs通过鼓阶注入到蜗轴，细胞在正常听力组和卡那霉素致聋豚鼠内保持有功能性。这些小鼠ESCs添加维A酸和PA6基质细胞后能够存活3周，有神经元标记物TuJ1表达，并发出神经突起伸向脑干。ABR显示注射组的阈值比损伤内耳不进行干细胞治疗组要高。同样，Hu等将ESCs通过蜗轴直接注射到听觉神经纤维，这些细胞表达GFAP（胶质细胞标记物）和NF（神经元细胞标记物）。注射后3周发现细胞在耳蜗的底圈和内听道。9周后细胞位于脑干和耳蜗腹侧核附近。Sakamoto等探讨了ESCs注射在成体小鼠用新霉素破坏后半规管后的应用。注射后4周，大多数注射细胞位于前庭区域，表达βⅢtubulin。极少注射细胞存在于耳蜗中阶，这些细胞不表达毛细胞标记物myosinⅦA。

Lang等将ESCs体外培养至表达nestin阶段后，分别导入内、外淋巴和蜗螺旋管。观察发现，导入外淋巴和蜗螺旋管中的ESCs最易存活，尤以造模早期阶段（造模后1～3d）导入存活率最高，其中导入外淋巴中的ESCs　50%分化成神经胶质细胞，导入螺旋管者20%分化成神经胶质样细胞，仅4．5%分化为神经元细胞；相比之下，导入内淋巴的ESCs则存活极少，这可能与导入过程本身易引起内外淋巴液的混合和离子失衡有关。上述结果表明，ESCs内耳植入后的存活情况取决于内耳微环境，植入ESCs的存活、分化及潜在功能的发挥主要限于损伤早期阶段。

Corrales等将携带EGFP的ESCs来源的神经祖细胞导入经毒毛花苷预处理沙鼠后。观察发现导入3d后的细胞仍表达EGFP，并能被神经元特异性标记物微管蛋白（tubulin）标记。导入后12d可见分化的神经细胞向Corti器生长；导入后64～98d神经细胞胞体发出大量神经突起，表达β－Ⅲ微管蛋白（β－Ⅲtubulin），后者从蜗管成簇发出经骨螺旋板到达Corti器，并与失去螺旋神经节细胞支配的毛细胞建立突触连接。与未导入ESCs的模型动物比较，实验组动物在靠近感觉上皮区细胞分化明显，说明ESCs来源的神经元有向模型动物神经退化特定部位分化生长的特点。

总之，ESCs能够整合到胚胎或成体损伤感觉上皮的内耳中。而且，ESCs可分化成神经源性细胞类型，比如毛细胞、支持细胞、胶质细胞和神经元的一些亚型。