细胞线粒体膜电位的染色及检测

（一）实验目的及原理

线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡早期的不可逆事件。线粒体膜内外的电势差降低,可引起线粒体膜内外一系列的生化改变，如诱导细胞色素C释放，活化caspase蛋白酶家族，呼吸链与氧化磷酸化失耦联，三磷酸腺苷(ATP)合成停止；线粒体膜通透性改变；凋亡诱导因子（AIF）的释放等，引起细胞凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡。

JC-1是一种阳离子染料，可在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体（monomer）存在，发射光以绿光（525nm）为主；而在高浓度时则可以形成多聚体（aggregation），发射光以红光（590nm）为主。线粒体本身存在一定的极性（polarization），其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+离子调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化（depolarization）时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势（membrane potential），而与线粒体形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。

（二）实验材料

JC-1探针；DMEM培养液；人胚肺成纤维细胞（WI-38），PBS等。

（三）实验流程

1.培养WI-38细胞。

2.将储备的JC-1（浓度为2μg/μl）荧光探针用含10%胎牛血清的DMEM5ml稀释，配成终浓度为10μg/ml的JC-1溶液。

3.将WI-38细胞培养板中的培养液吸出，PBS清洗2次，加入配好的探针溶液。

4.37℃孵箱孵育10min。

5.吸出培养液，PBS清洗2次，加入10%FBS的DMEM，上镜观察。

6.启动共聚焦显微镜，选择488nm氩离子激光和543nm的氦氖激光作为激发光，选择530±15nm和615±30nm通道作为接收通道。启动计算机，运行扫描软件，扫描图像。

7.最后将图像在相应的分析软件中进行处理。

（四）典型举例

本实验室证明转染正义人钠二羧酸转运蛋白3（hNaDC3）的WI-38细胞能够通过降低线粒体的膜电位加速细胞的衰老，见图1-35。

（五）注意事项

始终保持平衡染液中pH的一致性，因为pH的变化将影响膜电位。

图1-35　WI-38细胞JC-1检测线粒体膜电位变化（×600）

A.20代WI-38细胞；B.37代WI-38细胞；C.48代WI-38细胞；D.37代WI-38细胞转染对照；E.37代WI-38细胞转染AshNaDC3基因；F.37代WI-38细胞转染hNaDC3基因

参考文献

[1]Chen X,Cao D,Wang J,et al.Effects of human Na（+）/dicarboxylate cotransporter 3 on the replicative senescence of human embryonic lung diploid fibroblasts.J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2005,60:709-714.

[2]Wu D,Chen X,Guo D,et al.Knockdown of fibronectin induces mitochondria-dependent apoptosis in rat mesangial cells.J Am Soc Nephrol,2005,16:646-657.

[3]Haugland RP.The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10th ed.Eugene,OR:Molecular Probes,2005:chapter 12.