免疫学常用检查

实训八　免疫学常用检查

一、风湿性疾病检测

实训目的

可溶性抗原与相应抗体直接反应不出现凝集现象。将可溶性抗原包被在一种与免疫无关的颗粒状载体表面形成致敏颗粒，再与相应抗体反应，则出现凝集称间接凝集反应。常用的载体颗粒有人O型红细胞、绵羊红细胞、乳胶颗粒等。如载体颗粒是红细胞，称间接血凝试验；若为乳胶颗粒，则称为乳胶凝集试验。如果将抗体吸附到载体上，再与相应可溶性抗原反应，也可出现凝集，称为反相间接血凝试验。间接凝集反应具有敏感性高、快速、简便等优点，在临床上得到广泛的应用。如用乳胶凝集试验测定相关抗体，可用于辅助诊断钩体病、血吸虫病、类风湿性关节炎等。此外，用反相间接凝集试验测定抗原可作疾病早期诊断，如检测血清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及甲胎蛋白(AFP)等。

实训原理

1.间接凝集反应　人受溶血性链球菌感染后2～3周，体内便产生抗链球菌溶血素O的抗体。本试剂胶乳液(上海捷门生物技术合作公司)是由溶血素O和羧化聚苯乙烯胶乳共价交联而成的抗原胶乳，用来检验血清中有无抗链球菌溶血素O的抗体产生。ASO胶乳的灵敏度调整到200 U/ml，超过上述滴度即出现肉眼可见的凝聚颗粒，凡查出病人血清中次抗体效价显著升高，超过400单位，可认为患者近期被溶血性链球菌感染过，并用以辅助诊断风湿热、肾小球肾炎等病患。使用本试剂血清标本不需要稀释即可直接测定。

2.间接凝集反应　类风湿因子(RF)是一种主要发生于类风湿关节炎患者体内的抗人变性IgG抗体，可与IgG的Fc段结合。将变性IgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，此致敏胶乳在与待测血清中的RF相遇时，即可发生肉眼可见的凝集。本试剂胶乳液(上海捷门生物技术合作公司)是由纯化的人IgG和羧化聚苯乙烯胶乳共价交联而成的抗原胶乳。RF胶乳的灵敏度调整到20 IU/ml，超过上述滴度即出现肉眼可见凝集颗粒，使用本试剂血清标本不需要稀释即可直接测定。

实训内容

1.抗链球菌溶血素O试验

2.类风湿因子检测

实训准备

待检血清、类风湿因子(RF)测定试剂盒(胶乳凝集法)、生理盐水、抗链球菌溶血素“O”(ASO)测定试剂盒(胶乳凝集法)、反应板、记录本、记号笔等。

实训方法

1.经离心获得新鲜血清样本，贮存于2～8 ℃环境下，48小时内使用，时间过长则须冰冻贮存。将标本和检验申请单(常规检查)进行核对编号，防止“张冠李戴”。逐一进行检查，并把结果填写在报告单上，并签名和报告检验日期。

2.步骤

(1)抗链球菌溶血素O试验

①定性实验：试剂使用前，预置达室温；轻轻混匀胶乳试剂；核对阴性和阳性对照；在反应板孔中加一滴未稀释血清(50 μl)；然后加一滴胶乳试剂在血清中；搅匀、轻轻摇动使其充分混合，两分钟后观察结果。阴性和阳性对照同上法操作。

②半定量实验：血清以生理盐水(0.9 g氯化钠溶解于蒸馏水中，稀释至100 ml)倍比稀释，可参照表8-1操作。

表8-1　抗链球菌溶血素O半定量实验操作方法

(2)类风湿因子检测

①定性实验：试剂使用前，预置达室温；轻轻混匀胶乳试剂；核对阴性和阳性对照；在反应板孔中加一滴未稀释血清(20 μl)；然后加一滴胶乳试剂在血清中；搅匀、轻轻摇动使其充分混和，两分钟后观察结果。

②半定量实验：血清以生理盐水(0.9 g氯化钠溶解于蒸馏水中，稀释至100 ml)倍比稀释，可参照表8-2操作。

表8-2　类风湿因子检测半定量试验操作方法

3.正常结果

(1)抗链球菌溶血素O试验：正常参考范围：0～200 IU/ml。凝集出现可判断样本中ASO>200 IU/ml，阳性；无凝集出现可判断样本中ASO<200 IU/ml，阴性。本试剂适用于定性、半定量检测人体中抗链球菌溶血素“O”的含量。

(2)类风湿因子检测：正常参考范围：成人<20 IU/ml。凝集出现可判断样本中RF>20 IU/ml，阳性；无凝集出现可判断样本中RF<20 IU/ml，阴性。

4.注意事项

(1)抗链球菌溶血素O试验

①加试剂和阴性、阳性对照，保证滴液大小一致。

②若阴、阳性对照结果出现异常，则试剂不可使用。

③试剂盒贮存于2～10 ℃，受热会导致试剂阳性率偏高，但切勿冷冻。

④阴、阳性对照经检测尽管HBsAg、HCV、HIV为阴性，仍需如病人样品一样小心处理。

(2)类风湿因子检测

①加试剂和阴性、阳性对照，保证滴液大小一致。

②若阴、阳性对照结果出现异常，则试剂不可使用。

③本试剂样本血清加样量为20 μl，阴、阳性对照加样量是对照瓶中的一滴(约50 μl)。

④试剂盒贮存于2～10 ℃，受热会导致试剂阳性率偏高，但切勿冷冻。

⑤阴、阳性对照经检测尽管HbsAg、HCV、HIV为阴性，仍需如病人样品一样小心处理。

实训结果

填写或粘贴检验报告单。

实训思考

1.在凝集反应中，间接凝集反应的灵敏度为什么较直接凝集反应高？

2.什么是抗体的效价？如何保证试剂的质量？

(宇芙蓉　曹元应)

二、乙肝五项测定

实训目的

了解ELISA的类型、操作方法、结果观察及实际应用。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

实训原理

利用抗原、抗体反应后加入酶的底物，在酶的催化下发生水解氧化，生成有色产物。酶的活性与色泽呈正比，因而根据显色程度，检测出待检抗原与待检抗体的量。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，与临界(Cut off)值相比较，从而判定标本中人乙型肝炎五项指标的存在与否。

实训准备

乙肝五项试剂盒全套(s抗原、s抗体、e抗原、e抗体、c抗体，上海荣盛生物药业有限公司)、生理盐水、吸水纸、微量移液管等。

实训方法

(一)样本处理及要求

1.样本采集不需要特殊准备，不需要受检者禁食，按照正常的采血技术收集血液，全血样品最好先放置37 ℃处理2小时，再将血样品充分离心，3 000转/分钟离心6分钟左右以上，使血清(浆)不含或极少含血细胞。如果为抗凝血样品，应将血样品充分离心后，最好再放置于室温2小时以上。

2.样本可使用血清或血浆，肝素、EDTA或枸橼酸钠等抗凝剂，不会影响实验结果。

3.样本中含有叠氮钠会影响实验的结果，高度溶血的样本、没完全收缩的血清样本或有微生物污染的样本可能会引起错误的结果。

4.新鲜的标本在2～8 ℃无菌条件下可保存一星期，新鲜样本可长期储存在-20 ℃或以下，但应避免反复冻融。

(二)步骤

1.实验准备　从冷藏环境中取出试剂盒，在室温下平衡30分钟，同时将浓缩洗涤剂作1∶20稀释。

2.加待测标本　在微量反应板每孔加入待检标本50 μl，设阳性、阴性对照各2孔，每孔加入阳性(或阴性)对照各1滴，并设空白对照1孔。

3.加酶结合物　每孔加入酶结合物1滴(空白对照除外)，充分混匀，贴上胶纸封板，置37 ℃孵育30分钟。

4.洗板

(1)手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。

(2)洗板机洗板：选择洗涤5次的程序洗板，洗液应注满每孔，并保证每次洗净无残留，最后在吸水纸上拍干。

5.加显色液　先加显色剂A液，每孔1滴，再加显色剂B液，每孔1滴，充分混匀，封板，置37 ℃孵育15分钟。

6.终止反应　每孔加终止液1滴，充分混匀。

7.测定　用酶标仪读数，取波长450 nm，先用空白孔校零或双波长450/630 nm，然后读取各孔OD值，读数需在终止反应后10分钟内完成。

(三)正常结果

Cut off值：原倍血清COV=阴性对照平均OD值×0.3

1.3稀释血清COV=阴性对照平均OD值×0.5

样本OD值≧COV为阴性，样本OD值<COV为阳性

(四)注意事项

1.全部检测工作必须符合生物安全守则规定，严格防止交叉感染。操作时须戴手套，穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度。

2.本品仅用于体外诊断，仅限检测人体血清、血浆；检测结果作为诊断指标之一。

3.标本和酶结合物均应用加液器加注，并经常校对准确性，每次应该更换吸头吸取样本，操作过程中应尽量避免反应微孔中产生气泡。

4.所有标本，洗液和各种废物、弃物都应按传染物处理。

5.各批次试剂不能混用。

6.初试结果为阳性应做双孔复试。

实训结果

填写或粘贴检验报告单。

实训思考

1.乙肝五项指标的主要模式及临床意义是什么？

2.ELISA检测过程中洗板及做阴性和阳性对照的意义是什么？

病例分析

某患，男，26岁。乏力、厌油腻、恶心、肝区不适伴发热2周；皮肤、巩膜黄染；肝肋下2 cm，质略硬(Ⅱ°)，有压痛，脾肋下1 cm处可触及。血清转氨酶增高，ALT大于AST，ALB及GLO正常，TBIL升高，DBIL升高为主，肝炎标志物HAVIgM阳性(+)，乙肝“二对半”全阴。如何解释？

(宇芙蓉　曹元应)