培养细胞的蛋白质检测

培养细胞的蛋白质检测_组织工程学实验技

目前检测细胞中蛋白质的方法主要有蛋白质细胞化学法、免疫细胞化学法、酶联免疫吸附法（Enzyme－linked　immunoadsordent assay，ELISA）及免疫印迹法（Western Blot）。其中前两者较适于定性、定位观察，ELISA适于对培养细胞上清或细胞裂解液中蛋白质作定量测定，Western　Blot法适于定性与半定量测定。

一、蛋白质细胞化学法

细胞中蛋白质的染色方法有多种，本文介绍显示培养细胞骨架蛋白的方法。其原理是：当细胞用适当的Triton　X－100处理时，可将细胞膜和细胞内蛋白质溶解，而骨架系统的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而被显示。由于骨架系统中有些纤维（如微管）在该实验条件下不够稳定，而有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此显示看到的主要是微丝组成的微丝束，直径约在40nm左右。

【实验用品】

1．器材　移液器、吸管、培养皿、培养瓶，试管架等。

2．试剂

（1）RPMI　1640培养液、小牛血清、青霉素、链霉素。

（2）PBS（pH　7．2）：NaCl　8．0g，KCl　0．2 g，Na2HPO41．15g，KH2PO40．2g，蒸馏水100ml。

（3）pH　7．2M－缓冲液：咪唑50mmol／L 3．404g，KCl　50mmol／L　3．7g，MgCl2·6H2 O　0．5mol／L　101．65mg，乙二醇双（α－氨基乙基）醚四乙酸［ethyleneglycol　bis（2－aminoethyl－ether）tetraacetic　acid，EGTA］1mmol／L　380．35mg，EDTA0．1mmol／L 29．224mg，β－巯基乙醇1mmol／L　0．07ml，甘油4mol／L　292ml，加蒸馏水至1　000ml，用1mol／L　HCl调至pH7．2，室温保存。

（4）1%TritonX－100液：TritonX－100 1ml，M－缓冲液99ml。

（5）3%戊二醛液：25%戊二醛溶液3ml，PBS液97ml。

（6）0．2%考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R250　0．2g，甲醇46．5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46．5ml。

3．材料　体外培养的单层细胞。

【操作步骤】

1．将生长有单层培养细胞的盖玻片细胞面朝上放在小培养皿中，用PBS液洗涤3次，每次5min。

2．将玻片条浸在1%TritonX－100液的小培养皿中室温15～20min，以去除骨架以外的部分蛋白质。

3．立即用M－缓冲液轻轻洗涤3次，每次3min，使细胞骨架稳定。

4．在3%戊二醛液中固定10min，再用PBS洗涤数次，每次2～3min，取出玻片，吸去多余液体。

5．细胞面向上平放于载玻片上，滴加0．2%考马斯亮蓝R250染色液5～10min，蒸馏水冲洗1～2次，干燥后，细胞面朝上，在酒精灯上快速烘烤一下，立即入二甲苯透明2min，取出玻片，使细胞面朝下，盖在滴有树胶的载玻片上即可观察。

【结果分析】　细胞质中，分布着网状不规则蓝色纤维，细胞核圆形呈浅蓝色仅次于细胞中央，内有深蓝色核仁。

二、ELISA法

ELISA法的原理是：首先使抗原或抗体结合到固相载体表面并使其保持免疫活性，然后让抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或酶标抗体并保持免疫活性及酶的活性，加入受检标本（可以是抗原也可以是抗体）发生抗原抗体结合反应后，用洗涤的方法使固相载体上形成的免疫复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化生成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

ELISA可用于检测培养细胞分泌到培养上清液中的微量蛋白质，也可将培养细胞裂解后检测细胞内的蛋白质。ELISA具体方法的类型很多，但基本原理与过程相似，以下主要介绍常用的双抗夹心法。

【实验用品】

1．器材　移液器、酶联免疫检测仪、酶标板、透析袋、离心机、冰箱、水浴锅等。

2．试剂

（1）包被缓冲液（0．015mol／L　pH9．6碳酸缓冲液）：Na2CO31．6g、NaHCO30．29g加蒸馏水至1　000ml，另加入防腐剂NaN3 0．2g，4℃保存不超过2周。

（2）洗涤缓冲液（0．02mol／L　PBS pH7．4）：KH2PO40．2g、Na2HPO4·12H2O 2．9g、NaCl　8．0g、KCl　0．2g、Toween20　0．5 ml、NaN30．2g，加水定容至1　000ml，4℃保存备用。

（3）封闭液：0．1%牛血清清蛋白（bovine serum　albumin，BSA），0．01mol／L　pH7．4 PBS配制。

（4）底物溶液：0．05%二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）pH5．0（以0．05mol／L　Tris－HCl溶液稀释），并加入0．02%H2 O2。

（5）终止液（2mol／L　H2SO4）：先加水150ml，然后缓慢加入浓H2SO422．4ml，边加边搅拌，定容至200ml。

（6）待测蛋白质的抗体、HRP、0．1mol／L NaIO4、0．01mol／L乙酸钠缓冲液、2．5%乙二醇、4mg／ml　NaBH4、饱和硫酸铵等。

3．材料　体外培养细胞上清。

【操作步骤】

1．抗体的标记

（1）称取4mg　HRP溶于0．8ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0．1mol／L　NaIO40．2 ml，轻轻混摇20min，使HRP充分氧化，肉眼可见液体由棕黄色变成深绿色。

（2）加入2．5%乙二醇0．5ml终止氧化，在4℃冰箱中，液体对0．01mol／L乙酸钠缓冲液透析20h，6～8h更换透析1次，透析样品与缓冲液之比应为1∶5　000。

（3）加入0．2mol／L　pH9．6的碳酸缓冲液20μl，调整HRP液体的pH至9．5，立即加入含8．0μg待测蛋白质的抗体的水溶液（0．01mol／L　pH7．4的碳酸钠缓冲液溶解）1 ml轻轻混匀后，放置室温2h。

（4）加入0．1ml新鲜配制的4mg／ml NaBH4溶液，稳定酶标抗体复合物，置4℃2h。

（5）将上述混合液加入2ml饱和硫酸铵，冰箱放置30min后，5　000g离心10min，所得沉淀物溶于0．02mol／L　pH7．4PBS　1．0 ml中并透析过夜。

（6）次日以300g离心10min，去除不溶物，用0．02mol／L　pH7．4PBS加至5．0ml，4℃冰箱保存。

2．双抗夹心ELISA法

（1）包被：用包被缓冲液稀释包被单抗至5 μg／ml，按每孔100μl加入酶标板中，4℃过夜。

（2）弃包被液：每孔加入200μl封闭液，置37℃2h，弃之，以PBS洗涤液洗2次，甩干。

（3）加样：各孔加入100μl待测细胞培养上清，并设置空白对照和标准品对照的加样孔。同样加入相应的空白对照培养液和不同浓度的标准品稀释液，轻轻振动混匀，置37℃2h，弃之，PBS洗3次。

（4）加酶标抗体：加入HRP标记的待测蛋白质单抗，每孔加100μl，37℃2h，弃之，PBS洗3次。

（5）显色：每孔加入DAB－H2O2100μl，室温避光反应10min，加入50μl终止液，在酶联免疫检测仪490nm测定OD值。

（6）绘制标准曲线：以标准品为横坐标，OD值为纵坐标，以不同稀释度标准品OD值减去空白对照OD值，绘制曲线。

（7）计算样品含量：以样品OD值减空白对照OD值，将所得的值在曲线上查找相应的含量。

【注意事项】

1．ELISA法要求抗原浓度高和抗体效价高，还须严格消除干扰的杂抗原或抗体，以免出现假阳性或假阴性。

2．注意加样、保温、洗涤等步骤的操作的标准化，以免影响实验结果。

3．每次实验都必须设立空白与阳性对照。

4．封闭要完全、洗涤要彻底。

5．应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件。可通过设立浓度倍比稀释梯度进行测定。

三、蛋白质的十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium　dodecyl sulfate－polyacrylamide　gel　electrophoresis，SDS－PAGE）与免疫印迹法（Western　Blotting）

SDS－PAGE是目前常用的蛋白质电泳分析方法。其基本原理是：由丙烯酰胺（Acrylamide）和N′，N′－亚甲叉双丙烯酰胺（Bis）通过过硫酸铵提供并可被N′，N′－四甲基乙二胺（TEMED）的自由基引发一个链式反应，使丙烯酰胺单体聚合成长链，双功能基团N′，N′－亚甲叉双丙烯酰胺参与聚合反应时，链与链之间交联成凝胶，29个丙烯酰胺单体可形成1分子的交联体。SDS是一种阴离子去污剂，能使分子内和分子间的氢链断裂，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；强还原剂如β－巯基乙醇和二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫链断裂。当样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小及丙烯酰胺交联体的孔径大小（有一定的线性分离范围，不同浓度的胶有不同的孔径），而蛋白质本身所带电荷可以被忽略，从而根据分子量将各蛋白质亚基分开。

将电泳分离的蛋白质组分转移到固定膜，常用的固定膜有硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（polyvinylidene　difluoride，PVDF）膜上，然后以特异性抗体酶标二抗为探针，通过抗体－抗原反应及相应酶的显色系统将靶蛋白质（靶抗原）显示出来，称蛋白质免疫印迹法。

【实验用品】

1．器材　移液器、离心机、冰箱、水浴锅、摇床、超声破碎仪、电泳及电转移系统、细胞刮子、X－胶片、带增感屏的X线暗盒、暗室与安全灯等。

2．试剂

（1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N′，N′－亚甲叉双丙烯酰胺1g，加水至100ml，避光保存于棕色瓶内。

（2）1．5mol／L　pH8．8Tris－HCl：18．165 g　Tris用80ml水溶解后，HCl调pH至8．8，加水至100ml。

（3）1．0mol／L　pH6．8Tris－HCl：12．14g Tris用80ml水溶解后，HCl调pH至6．8，加水至100ml。

（4）1×SDS上样缓冲液：62．5mmol／L Tris－HCl　pH6．8，2%W／V　SDS，10%甘油，50mmol／L　DTT或5%β－巯基乙醇，0．01% W／V溴酚蓝。

（5）Tris－甘氨酸电泳缓冲液：25mmol／L Tris，250mM甘氨酸，0．1%SDS。可配成5 ×储备液，900ml水中溶解15．1g　Tris　base和94g甘氨酸，然后加入50ml　W／V　10% SDS，用水补至1　000ml。

（6）10×TBS：24．2g　Tris　base，80g NaCl，加入800ml水，用HCl调pH至7．6，加入至1　000ml。

（7）封闭缓冲液：1×TBS，0．1%Tween－20，5%W／V脱脂奶粉。

（8）转移缓冲液：25mmol／L　Tris　base，0．2M甘氨酸，20% 甲醇（pH　8．5）。1　000ml转移缓冲液，称取2．9g甘氮酸、5．8g　Tris　base、0．37g　SDS，加入200ml甲醇，加水至总量为1　000ml。

（9）TBST：1×TBS，0．1%Tween－20。

（10）抗体孵育液：封闭缓冲液中按抗体说明书的效价比加入相应的一抗或二抗。

（11）其他试剂：10%过硫酸铵（去离子水配制，4℃储存，1周内使用）、TEMED、10% SDS、PBS缓冲液、70%乙醇。待测蛋白质的抗体、HRP标记的二抗、化学发光试剂（使用前0．5h将A、B液混合）、显影液、定影液。

3．材料　体外培养的细胞。

【操作步骤】

1．样品制备

（1）对于悬浮生长细胞：于0℃以PBS充分洗涤细胞，4℃以3　000g离心5min，彻底吸除上清，加入约5倍细胞沉淀体积的1×SDS上样缓冲液，充分混匀。

（2）对于贴壁生长细胞：可用PBS漂洗细胞2次，弃去洗液并吸净残余的PBS液体；加入1×SDS上样缓冲液（90mm培养皿加入100～200μl），用细胞刮子将黏稠的细胞裂解物收集于微量离心管中。也可用胰蛋白酶消化后制备细胞悬液，再与悬浮生长细胞同样处理。

（3）如细胞裂解物黏稠度太大，可用超声破碎仪以最大功率处理0．5～2min，以剪切DNA。

（4）将样品置沸水浴中加热10min，1× 104g离心10min后取上清，－20℃可保存1个月。

2．制备凝胶

（1）将电泳槽清洗干净，蒸馏水洗净后烘干，玻璃板清洗后用70%乙醇擦净，烘干。

（2）装好灌胶装置，根据目的蛋白的分子量按表3－1确定凝胶浓度体积，按表3－2顺序配制分离胶溶液，一旦加入TEMED，混匀后立即小心加入灌胶装置至整体体积的3／5，在胶上加入适量的水或70%乙醇，室温下1h。

（3）胶凝结后倾去水或乙醇，按表3－2配制好积层胶，加至玻璃上缘，插入梳子，使浓缩胶为0．6～1mm高，室温1h胶凝结后拔出梳子，用1×电泳缓冲液将每个梳孔清洗1次。

表3－1　SDS－PAGE胶的有效分离范围

注：丙烯酰胺与N′，N′－亚甲叉双丙烯酰胺摩尔比为29∶1

表3－2　配制Tris－ 甘氨酸SDS－PAGE电泳分离胶与积层胶所用溶液（ml）

（续　表）

3．上样　样品上样前还需再次煮沸3～5min并离心1×104g　10min，如样品缓冲液中使用β－巯基乙醇作为还原剂还需再补加5%β－巯基乙醇。按次序上样，注意加蛋白质分子量标准，最好将1×SDS上样缓冲液加入未使用的梳孔内。

4．电泳　先以低电压（约8V／cm）电泳至指示剂前缘到达分离胶，加高电压（约15V／cm）继续电泳至溴酚蓝到达胶下缘，停止电泳。剥离凝胶，放入转移缓冲液内。

5．电转移　剪一张凝胶大小的硝酸纤维素膜及4张新华滤纸浸入转移缓冲液，按下列顺序做好夹心层：阴极夹板－海绵－滤纸－凝胶－硝酸纤维素膜－滤纸－海绵－阳极夹板，操作时，滤纸和膜应操持湿润，切忌干燥，各层之间应排除气泡，硝酸纤维素膜、滤纸和凝胶大小应一致。置夹心层于电泳槽中，凝胶对阴极，膜对阳极。4℃，60V电转移2～3h（转移时间和电压应根据目的蛋白质分子量而定，分子量越大，所需电压越高，转移时间越长）。以上过程需戴手套操作，以免污染膜。

6．关闭电源，取出膜，TBS／TBST洗1次，5min（此步可选）。

7．封闭缓冲液室温封闭1h，TBS／TBST洗3次，每次5min。

8．一抗孵育液中室温1h，TBS／TBST洗3次，每次5min。

9．二抗孵育液中室温1h，TBS／TBST洗3次，每次5min。

10．取出膜，稍沥干后放入装有化学发光试剂的平皿中，室温1min。

11．取出膜，稍沥干后用保鲜膜包好，放入X线暗盒，在暗室中将一张X－胶片压在膜上，曝光约1min（时间依信号强弱而定）。

12．取出X线片，显影、定影，冲洗，晾干后扫描保存。

【结果分析】　根据曝光显示的条带的有无、强弱，对照蛋白质分子量标准参照物的迁移距离，可判定目的蛋白的有无及量的多少。利用“自动灰度扫描仪”扫描条带，计算积分光密度值，以内参照（如看家基因actin）蛋白质条带的积分光密度为校正值，可以进行半定量分析。

【注意事项】

1．丙烯酰胺有神经毒，可以皮肤、呼吸道等吸收，故操作时应注意保护。

2．加样的量要合适，避免超载。

3．对许多蛋白质而言，电泳速度越大则电泳条带越清晰，但电流太大，玻璃板会受热而破裂。

4．HRP－标记的二抗显色系统有多种，目前最常用的是鲁米诺（luminol）化学发光系统，其灵敏度高、结果稳定，有商品供应。