糖类代谢试验

一、糖类代谢试验

(一)糖(醇、苷)类发酵试验

1．原理　　由于细菌含有发酵不同糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等)的酶，因而对各种糖、醇、苷类的分解能力不同，其代谢产物也不同。有的能分解某些糖类产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，还有的不能分解糖类。产生的酸使培养基pH值下降，从而使培养基中的指示剂变色。

2．方法　将细菌接种到糖(醇)发酵培养基中，培养18～24 h后，观察结果。能分解糖产酸时，呈酸性反应;若反应产气，培养基内可出现气泡或裂隙等;若不分解糖类，除有细菌生长外，无任何变化(彩图1)。

3．应用　是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。

(二)氧化－发酵试验(O/F试验)

1．原理　细菌必须在有氧条件下分解葡萄糖的称为氧化型;在有氧或无氧条件下都能分解葡萄糖的称为发酵型细菌;不分解葡萄糖的细菌为产碱型。

2．方法　　将待检菌穿刺接种HL(Hugh－Leifson)高层培养基，孵育18～24 h。高层上半部分变黄，为氧化型产酸;整个培养基变黄，为发酵型产酸;不变或变蓝为阴性或产碱型(彩图2)。

3．应用　　主要用于肠杆菌科细菌和非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。此外，也可用于葡萄球菌属和微球菌属的鉴别。

(三)β－半乳糖苷酶试验

1．原理　　细菌分解乳糖必须有两种酶，一种是半乳糖苷渗透酶，它可将乳糖通过细菌的细胞壁，送到细胞内;另一种是β－半乳糖苷酶，存在于菌细胞内，它可将进入菌细胞的乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。分解乳糖的细菌皆具有上述两种酶，才可以快速分解乳糖。迟缓分解乳糖的细菌只有β－半乳糖苷酶，而缺乏半乳糖苷渗透酶或其活性很弱，不能将乳糖快速运送到细胞内，所以通常需要几天时间乳糖才被分解。而邻硝基酚－β－D－半乳糖苷(ONPG)分子结构与乳糖分子相似，且分子较小，不需半乳糖苷渗透酶的运送即可通过细胞壁进入到菌细胞内，由细胞内的β－半乳糖苷酶将其分解为半乳糖和肉眼可见的黄色邻硝基酚，即使β－半乳糖苷酶的浓度很低也能检出。

2．方法　取培养物于0．25 mL无菌生理盐水中制成菌悬液，加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5 min，加入0．25 mLONPG试剂，水浴20 min至3 h后观察结果。菌悬液呈现黄色为阳性，一般在20～30 min内显色。无色为阴性。

3．应用　迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验用于迟缓发酵乳糖菌株的鉴定。

(四)七叶苷水解试验

1．原理　　某些细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。

2．方法　将待检菌接种于七叶苷培养基中，35℃孵育18～24 h后观察结果。培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。

3．应用　主要用于肠球菌属与D群链球菌和其他链球菌的鉴别。

(五)甲基红试验(M－R试验)

1．原理　　某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等有机酸，使培养基中的pH值降至4．5以下，使加入的甲基红试剂呈红色，为阳性。有些细菌虽然也能分解葡萄糖但产酸量少，pH值在6．2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。

2．方法　将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35℃培养18～24 h，加入甲基红试剂2～3滴，轻轻摇动立即观察结果。呈现红色为阳性;橘红色为弱阳性;黄色为阴性(彩图3)。注意孵育时间不得少于18 h，否则可造成假阴性。

3．应用　主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、克雷伯菌属则为阴性。

(六)V－P试验

1．原理　　某些细菌能产生丙酮酸脱羧酶，可使培养基中的葡萄糖分解产生的丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中易被氧化为二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等所含的胍基反应生成红色化合物。

2．试剂VP试剂(甲液为6%α－萘酚酒精溶液;乙液为40% KOH溶液)。

3．方法　将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，于35℃培养24～48 h后滴加甲液0．6 mL，混匀后再滴加乙液0．2 mL，充分振摇30 s至1 min后观察结果。在数分钟内出现红色为阳性;如未出现红色应置35℃4 h后再判定，仍无红色出现者即为阴性(彩图4)。

4．应用　主要用于肠杆菌科鉴别。常与甲基红试验联用，前者阳性的细菌，后者通常为阴性;反之，亦然。