致泻性大肠埃希菌

三、致泻性大肠埃希菌

根据血清型别、毒力和所致临床症状，致泻性大肠埃希菌可分为产肠毒素性大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）以及肠黏附性大肠埃希菌（EAEC）五类。

1．常规分离鉴定技术

（1）细菌学检查：粪便标本直接接种EMB或麦康凯琼脂平板。血液需先经肉汤增菌，再转种血琼脂平板。食品、水等相关食源性标本采集后应尽快检验。具体步骤参照GB／T4789．6-2003方法和《临床检验操作规程》进行。

（2）血清学检查

1）凝集试验：主要有试管凝集、玻片凝集、乳胶凝集3种。玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法，实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时，可100℃加热菌液30分钟再行玻片凝集试验。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性，应继而做试管凝集反应，所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验，并应先对待检菌做动力试验，在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。

2）酶联免疫法：用ELISA法可直接检测粪便中O157：H7大肠埃希菌抗原。

3）免疫磁分离法：Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠埃希菌O157∶H7。在一起经牛奶传播的大肠埃希菌O157∶H7暴发中，用IMS，粪便培养和聚合酶链反应（PCR）检测Vero毒素基因的携带，用3种方法对粪便大肠埃希菌O157∶H7的分离率作比较结果，在受检的142份粪便标本中，直接培养和IMS均阳性20份，另13份仅IMS阳性。因此，IMS提高了大肠埃希菌O157∶H7感染病例的检出率，与PCR符合率高。

（3）快速酶触反应：大肠埃希菌具β-葡萄糖醛酸酶，但以O157∶H7为代表的肠出血性大肠埃希菌（EHEC）却不具此酶，故β-葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查EHEC的重要特征。检测最低限可达100CFU／ml。

（4）毒素及毒力因子检测：包括LT，ST，Hly，SLT，Stx，EaeA，VT和EAST等。过去多用动物或细胞培养测定，现可用其单抗以多种免疫学手段检出，也可用基因探针技术或PCR等分子生物学技术检测。

（5）基因探针和PCR技术：Ye利用荧光标记的一对引物扩增256 bp的Stx2做定量分析鉴定O157∶H7产毒株。中国徐建国根据溶血素hlyAB基因序列设计了鉴定EHEC的特异DNA探针，敏感性和特异性达99％。Fortin将套式PCR技术和荧光探针技术相结合来检测O157，该方法不仅可以鉴别与O157抗血清有交叉反应的菌株，而且灵敏度高，可检测牛奶和苹果汁中100CFU／ml的细菌，如果先进行6小时增菌，可检测1CFU／ml的细菌。

（6）细胞黏附试验：传统的细胞黏附试验是检测EIEC的标准方法。方法为在24孔板的孔中圆形玻片上培养的HEP-2细胞单层，生长至50％；待检菌以L肉汤培养，37℃、静止培养16小时；每孔加入20μl菌液（含2×10⁷个菌），置37℃、5％ CO₂温育3小时，培养液中含1％α-甲基-D-甘露醇；Hank摧s平衡盐溶液洗培养板3次；70％乙醇固定，10％ Giema染色；取出圆形玻片，置载玻片上，油镜观察。

2．流行病学调查分型方法

（1）血清型分型技术：大肠埃希菌包括O，K，H，F抗原4种。O抗原共171种，其中162种与腹泻有关，是分群的基础。K抗原103种。从病人新分离的大肠埃希菌多有K抗原。根据耐热性等不同，K抗原分为L，A，B 3种，其中L，B不耐热，有60种。F抗原至少有5种，与大肠埃希菌的黏附作用有关。血清型的表示方式可按O∶K∶H排列，如O111∶K58（B4）∶H2；O∶K排列，如O8∶K88；O∶H排列，如O168∶H27。

（2）噬菌体分型：1987年曾用16种噬菌体的裂解模式，将分别来自美国和加拿大的98株O157∶H7分成14个噬菌体型。目前，通过对噬菌体感受性的不同，已获得80余种噬菌体型。

（3）脉冲场电泳分型：Subhra等（2001）用核糖体分型和脉冲肠电泳技术，对印度急性分泌型腹泻病人中分离的ETEC病原菌分析表明，血清型相同的ETEC菌株具有遗传异质性，虽然在不同血清型的ETEC菌株中也能观察到相同的PFEG模式。PFGE指纹图在O157暴发流行中的作用已得到证明。

（4）随机引物扩增DNA多态性和扩增片段长度多态性分析分型技术：Pacheco等用随机扩增多态性DNA技术（RAPD）和脉冲场凝胶电泳分析，发现具有相同表型特征的ETEC菌株，用分子生物学分型方法能揭示菌株间的差异，这些差异往往不能在对ETEC的表型分型中显示出来。Iyoda用扩增片段长度多态性（AFLP）对46株O157∶H7及其他血清型O26∶H11，O114∶H19，O119∶NT的分析结果，相同的O157∶H7暴发流行具有同一AFLP带，并属于相同的亚型，而其他血清型的条带完全不同，该结果与PFGE一致。