在手术过程中，虽然器械和物品都已灭菌、消毒，手术人员也已洗手、消毒、穿戴无菌手术衣和手套，患者手术区又已消毒和铺盖无菌布单，为手术已提供了一个无菌操作的环境。在手术进行中，如果没有一定的规则来保持这种无菌环境，则已经灭菌和消毒的物品或手术区域仍有受到污染和引起伤口感染的可能。有时可因此而使手术失败，甚至影响患者的生命。这种所有参加手术的人员必须认真执行的规章，即称为无菌操作规则。术中无菌技术是整个手术无菌术的核心。手术时间长、环节多、人员杂，特别是在手术紧张时，稍有不慎，即可使无菌技术遭到破坏。所有参加手术的人员必须认真对待，互相监督，并遵守以下规则。若发现有人违反，必须立即予以纠正。无菌操作规则包括：
（1）手术人员穿无菌手术衣和戴无菌手套之后，手不能接触背部、腰部以下和肩部以上部位；同样，也不要接触手术台边缘以下的布单。
（2）器械应从手术人员的胸前传递，不可从术者身后或头部传递，必要时可从术者手臂下传递，但不得低于手术台的边缘，手术者不可随意伸臂横过手术区取器械。坠落到无菌巾或手术台边以外的器械物品，不准拾回再用。
（3）保持无菌巾干燥，取用无菌溶液时防止液体外溅，无菌巾一旦浸湿，应立即更换或加层。软包装的无菌溶液打开后，应一次用完不保留。若为瓶装溶液必须保留时，应注明时间，并及时盖好瓶盖避免污染。无菌包坠落地面、无菌区建立超过24h，不可使用。手套破口，及时更换。未经消毒的手不要跨越无菌区。
（4）手术中如手套破损或接触到有菌地方，应更换无菌手套。如前臂或肘部触碰有菌地方，应更换无菌手术衣或加套无菌袖套。如无菌巾、布单等已被湿透，其无菌隔离作用不再完整，应加盖干的无菌布单。
（5）切口边缘应以无菌大纱布垫或手术巾遮盖，并用巾钳或缝线固定，仅显露手术切口。术前手术区粘贴无菌塑料薄膜可达到相同目的。
（6）在手术过程中，手术人员更换位置时，如两人邻近，先由一人双手放于胸前，与交换者采用背靠背形式交换，如非邻近，则由双方先面向手术台退出，然后交换。
（7）手术开始前要清点器械、敷料，手术结束时，检查胸、腹等体腔，待核对器械、敷料数无误后，才能关闭切口，以免异物遗留腔内，产生严重后果。
（8）手术人员的手不要接触切口周围皮肤。切皮后，应更换手术刀片和盐水垫，铺皮肤保护巾或贴手术薄膜。处理空腔脏器残端时，应用盐水垫保护周围组织，以防止或减少污染。已污染的刀剪、敷料等，必须另放于弯盆中，不能放回无菌区。缝皮前，应冲洗切口，洗净手套上的血迹，去除皮肤保护巾或手术薄膜，用75%乙醇消毒周围组织后，再行缝合。
（9）术中如进行X线摄片等因故暂停时，应用无菌单将切口及手术区遮盖，防止污染。
（10）口罩潮湿后及时更换，手术人员咳嗽、打喷嚏时，应将头转离无菌区。及时擦拭手术者的汗液，避免滴落在手术台上。
（11）参观手术的人员不可太靠近手术人员或站得太高，也不可经常在室内走动，以减少污染的机会。
（12）手术进行时不应开窗通风或用电扇，室内空调机风口也不能吹向手术台，以免扬起尘埃，污染手术室内空气。
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