猫爪草抗肿瘤有效成分脂肪酸提取工艺的研究

近年来超临界CO2萃取（SFE）技术在脂肪酸提取中得到了广泛应用，本节参照有关文献，采用正交实验设计，以十六碳酸为主要考察指标，对猫爪草脂肪酸成分的SFE提取条件进行了优化筛选，然后又对回流提取、超声提取与SFE方法进行了比较，确定了脂肪酸的最佳提取工艺。

（一）主要仪器和材料

GCMS－QP5050A气相色谱－质谱联用仪，DB－5石英毛细管柱（30m×0．25mm）；Chromatopac C－E1B数据处理机，KY－GC／MS－DS2数据系统，超临界萃取装置。猫爪草乙酸乙酯部位（自制），十六碳酸甲酯对照品等。

（二）方法与结果

1．十六碳酸含量测定方法

（1）GC－MS分析条件：载气为高纯氦气。气柱前压：63．1kPa；分流比：20∶1；气化室温度：290℃；离子源温度：260℃；程序升温：150～250℃，8℃／min，恒温3min；250～300℃，15℃／min，恒温2min。质谱条件：电子轰击源EI；电子能量70eV；扫描质量范围：35～500m／z。用峰面积归一化法计算化合物的相对含量。

（2）标准曲线的绘制：精密称取十六碳酸甲酯标准品0．5987g，用正庚烷定溶至50ml。分别精密吸取1、2、4、6、8ml至25ml容量瓶，定容，作为标准品溶液。精密吸取各浓度标准品溶液，采用（1）条件进样1μl，每个样进3次，以平均峰面积（Y）为纵坐标，以标准液进样量（X）μg为横坐标，进行线性回归，结果回归方程为Y＝4×108　X＋3×106，r＝0．9996，十六碳酸甲酯在3．83～0．48μg范围内线性关系良好（图3－2）。

图3－2　十六碳酸甲酯标准曲线图

（3）样品中脂肪酸的测定：将猫爪草按脂肪酸提取工艺所得组分用乙醚溶解，过滤，置于分液漏斗中（用水饱和），加15%NaOH萃取2次。取下层水溶液，再用HCl调pH为3。然后加用水饱和的乙醚约15ml萃取2次。水浴上挥干乙醚，得到总脂肪酸，精密称量即得。

（4）样品中十六碳酸含量的测定：精密称取（3）所得脂肪酸约0．2g，用适量正己烷溶解，加1ml　14%三氟化硼／甲醇溶液，100℃水浴保温2min后取出，用自来水冷却，加蒸馏水1ml，正己烷2ml，3000r／min离心15min，取上清液作为十六碳酸甲酯化待测样品。采用（1）条件进样2μl，按标准曲线法计算含量。

2．超临界CO2萃取法（SFE）提取条件的正交设计

（1）单因素考察

①萃取压力：通过预实验发现当萃取压力低于15MPa时，萃取物的收率明显降低。在参考有关文献的基础上，我们选择20～30MPa的范围内考察萃取压力对提取率的影响。

②萃取温度：温度对提高超临界流体溶解度的影响存在两种趋势，一方面温度升高超临界流体密度降低，其溶解能力下降，导致萃取数量的减少；但另一方面，温度升高，使萃取溶质的挥发性增加，这样就增加了被萃取物在超临界气相中的浓度，从而使萃取数量增加。

通过实验发现，当温度低于40℃时，第一方面的影响是主要的，萃取物收率很低；另外考虑到若温度过高，可能会破坏某些成分。故选择在40～60℃的范围内考察萃取温度对提取物收率的影响。

③萃取时间：从理论上讲，萃取时间越长越好，萃取越完全。但是萃取时间过长会造成能耗增加，单位时间内得到产物较小，使成本增加。另一方面，若萃取时间过短时，会使萃取物收率过低。经过预试验发现，时间低于1．5h时，药物提取明显不完全，而时间在2～3h时，便可以得到较为满意的收率。

④CO2流量：CO2流量与CO2的溶解能力有两种趋势：一方面流量加快时，停留时间短，与萃取物接触的时间减少，因而流体中溶质的含量降低；另一方面，流量加大可以增加溶剂对原料的萃取次数，并且能够迅速地将被溶解的溶质从原料表面带走，缩短了萃取时间。在流量过低时，尽管单位体积的CO2中所含的溶质较多，CO2的用量较少，但完成萃取的时间较长，产量小，效率低。参照有关文献选择在15～35kg／h的范围内考察CO2流量的影响。

⑤夹带剂：夹带剂主要是为了增加CO2流体的极性，可以萃取出极性较大的物质。但是猫爪草乙酸乙酯有效部位主要是一些亲脂类物质，所以未考虑夹带剂的影响。预实验表明，加入95%的乙醇后药物的提取率明显降低。

⑥药粉粒度：原料的颗粒越小，与CO2接触的表面积越大，萃取进行的越快、越完全，但是粒度太小容易造成萃取器出口的过滤网堵塞。经过预试验发现颗粒在20～60目时，被萃取物的收率没有明显差异，故选用20目的颗粒。

（2）正交设计及结果：在（1）“单因素考察”的基础上，确定以十六碳酸甲酯的含量和脂肪酸的收率为指标，考察萃取压力、萃取温度、萃取时间及CO2流量4个因素，制定各因素的水平范围，见表3－7。以L9（34）正交表进行试验，每次实验准确称取猫爪草1．5kg，粉碎过20目筛，按正交试验表中各水平进行超临界萃取，提取完后收集组分，按照含量测定项下的内容测定脂肪酸及十六碳酸甲酯的含量，结果见表3－8，方差分析结果见表3－9。

表3－7　猫爪草超临界萃取因素水平表

表3－8　正交试验及结果

表3－9　方差分析表

F0．01（2，2）＝99．00　F0．05（2，2）＝19．00

以十六碳酸含量和脂肪酸的收率的综合评价值为指标，表中极差R大小显示，各因素作用主次为：B＞A＞C＞D。表中的方差分析结果表明：在A因素（P＜0．05）、B因素（P＜0．01）、C因素（P＞0．05）中，B因素（萃取时间）和A因素（萃取压力）的影响具有显著性意义，从直观分析得知，最佳提取工艺组合为：A2B2C2D1，即压力为25MPa，萃取温度为50℃，时间3．0h，CO2流量为30kg／h。

（3）重现性验证实验：在确定提取工艺条件后，按优选工艺条件进行3批试验，测得十六碳酸平均含量（以十六碳酸甲酯计）为92．54%。结果表明该工艺重现性良好（表3－10）。

表3－10　验证试验结果

3．其他提取工艺与超临界的比较

（1）提取溶媒的选择：取同批猫爪草适量，粉碎过40目筛。准确称取50g，分别以环己烷、乙醚、乙酸乙酯、甲醇超声提取30min，按照1．中（3）（4）含量测定项下的内容测定脂肪酸及十六碳酸甲酯的含量，结果表明，乙酸乙酯提取较好，结果见表3－11。

（2）提取方法的比较：取同批药材分别用乙酸乙酯以热回流、索氏提取及超声法提取，提取液回收乙酸乙酯，按照1．中（3）及（4）含量测定项下的内容测定脂肪酸及十六碳酸甲酯的含量，结果见表3－12。表3－12结果表明，回流法提取率较低，超声法提取较好。进一步与超临界提取方法比较，证实超临界法为最佳提取方法。

表3－11　猫爪草脂肪酸提取溶媒的比较

表3－12　猫爪草脂肪酸提取方法的比较（n＝3）

本实验通过正交试验设计，考察了猫爪草中有效成分十六碳酸的SFE提取条件，同时对不同提取溶媒和提取方法进行了比较，确定十六碳酸的最佳提取工艺为超临界CO2萃取（SFE）。具体条件为压力25MPa，萃取温度50℃，时间3．0h，CO2流量40kg／h，提取率90%以上。为从猫爪草中提取含量较高的抗肿瘤活性成分提供了实验依据。