方法建立的一般步骤

3.2.2.1　检测条件的选择

取待测药物标准物质按拟定的测定方法进行分析，了解浓度与测定响应值(如吸光度、色谱峰高或面积等)之间的关系，确定线性范围、最适测定浓度、检测限和测定的最适条件(pH、温度、反应时间)等。采用色谱法测定时，可通过调整色谱柱(型号、填料与粒径、柱长)、流动相(组分及其配比)及流速、柱温、检测波长、进样量、内标浓度及其加入量、样品预处理方法等条件，使各物质具有良好的色谱分离效果。通过选择适当的检测器，获得足够的方法灵敏度。

3.2.2.2　考察内源性物质的干扰，优化样品预处理方法

取空白生物基质，如空白血浆，采用拟定的方法进行测定，生物基质中的内源性物质应当对待测药物、内标无干扰(方法特异性)。如有干扰，需进一步优化样品前处理方法。

3.2.2.3　方法学验证

取空白生物基质，加入待测药物标准溶液制成模拟生物样品，采用拟定的预处理及测定方法进行分析，考察方法的线性范围、精密度与准确度、检测限以及提取回收率等技术指标，并进一步检验生物基质中内源性物质对待测药物的干扰程度，判断方法对检测目的的适用性。

3.2.2.4　体内实际样品测定

有时用体外建立的方法去测定体内取得的实际生物样品时，会得出错误的结论。因为药物在体内可能与内源性物质结合(如与血浆蛋白结合)，或者经过各相药物代谢酶的作用后生成多个代谢产物，使得药物在体内的存在形式变得更为复杂，因此要强调对药物体内过程有一定程度的了解。在分析方法初步建立后，需要进行实际生物样品的测定，考察代谢产物对药物、内标的干扰情况，以及方法灵敏度，进一步验证方法的可行性。有时也采用专属性强、已证明适用于体内实样测定的步骤和方法作为对照测定，并以此来检验所建立的方法的可行性。

3.2.2.5　内标物的选择

内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除因操作条件的波动而引起的分析结果误差，提高分析结果的准确度。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱柱分离，又不受待测样品中其他组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择很关键。合适的内标物应符合以下条件:①内标物应是待测样品中不存在的纯物质;②它必须完全溶于待测样品中，并与样品中各组分的色谱峰能完全分离;③加入内标物的量应接近于待测组分;④色谱峰的位置应与待测组分的色谱峰的位置相近，或在几个待测组分色谱峰中间。通常情况下选择的内标物质和被分析的样品组分有相似的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。同位素标记的内标物在选择质谱为检测手段时具有独特的优势，具体情况在“3.3.7基质效应”中进行介绍。