分型图谱异常原因分析

二、STR分型图谱异常原因分析

（一）实验技术人员的主观原因

1．仪器的设置不当及相关试剂质量未检验

（1）分析软件、参数的设置不当。每1台DNA遗传分析仪被买进来时，都需要对其中的分析软件和参数进行设置，如ABI PRISM 310遗传分析仪在Analysis Method Editor分析界面中要设置好分析范围，在确认allele的时候要确定好每1个等位基因的bin值（Panel Manager界面）。如果这些工作没有做好或设置得不合适，就会出现整个图谱的基因座移位或等位基因出现偏移。

（2）内标（size standards）受到污染。

（3）毛细管（或其中的凝胶）受到污染。

（4）试剂质量不合格，或部分试剂盒的引物纯度太低，导致PCR产物的影子带（stutter band）的峰高超过其主带的15%。

（5）使用配制后放置时间过长的Chelex 100（致pH值降低），或使用时其浓度过稀，如吸取前没有摇匀或其没有与检材充分作用。

2．实验操作不当

（1）模板DNA质量问题①检材受到污染、DNA提取过程操作不当、操作程序不合理，使模板DNA中杂质含量过多；②DNA模板中尚含PCR抑制物，影响PCR效率。

（2）模板DNA浓度不合适①检材取样量过多（或加入的提取液用量太少），导致模板DNA浓度过高；②检材取样量过少（或加入的提取液用量太多），导致模板DNA浓度过低。

3．PCR反应体系中的非模板因素如DNA聚合酶活性降低（某些试剂盒本身质量欠佳或保管不当），反应体系中各种成分的比例不合适等。

4．PCR反应的体积过小一般PCR商品试剂盒的使用说明书要求1个PCR反应使用50 μL体积，但是有实验者实际使用5 μL的体积，这时容易造成反应成分的比例不合适，结果导致DNA图谱出现异常。所以，使用与试剂盒说明书不同体积的反应体系时必须预先经过论证。

（二）检材本身存在特殊性

1．微量或腐败检材

（1）检材中含的DNA量太少，这是微量检材最常遇到的问题。

（2）检材太陈旧、在地下掩埋的时间太长、检材高度腐败导致DNA大分子严重降解，都不能满足后续的实验要求。

（3）对于病理玻片或福尔马林固定的组织，其DNA大分子的提取难度很大，或只能提取出来严重降解的DNA片段，影响后续的实验。病理玻片中的组织经过染色，也会干扰荧光标记STR分型。

2．分析软件设计的先天不足OL（off-ladder）现象：出现OL现象，是软件开发商在设置软件定义等位基因时，调查的人群数量不足，尚未发现该等位基因的存在，因此，未包含在等位基因的ladder中。

3．遗传变异现象这类现象在STR分型中十分常见。可以有下列类型。

（1）STR序列重复单位的遗传变异①重复单位数量的变异，有one-，two-，multiple-step mutation，即是相差1个、2个或多个重复单位的STR变异；②重复单位非整数的变异，其特点是STR序列的变异表现为小于1个重复单位，被称为microvariant，又将其称为“微变异”。

（2）STR序列两翼序列的变异重复序列侧翼引物结合序列的变异，会造成引物无法与此类模板DNA结合，这种变异常常造成该等位基因漏扩，这种现象又称为drop out，易将杂合子个体误认为纯合子。这时往往出现父（母）、子各自都是不同等位基因的“纯合子”现象，也有人称之为null allele。

（3）重复序列拷贝数的变异这是一种相当常见的变异。单一个体的1个基因座会有3个等位基因（3个荧光峰），称为3-allele现象。在至今报道的商品化试剂盒里的基因座中几乎都发现了3-allele现象。关于3-allele现象的发生原因，有多种解释，如有人认为是基因重排或转座现象。

（4）三体综合征（trisomy syndrome）21，18和X三体综合征是其中最常见的。其STR分型图谱的特点是处于该染色体上的STR基因座会出现3个等位基因的现象。这3个等位基因可以是完全不同的，图谱表现出3个峰；也可以是表现为2个峰，但其中一个峰的高度是另一个峰的2倍；第3种情况则可以表现为1个峰高特别显著的单峰（3个等位基因相同）。

（5）嵌合体（chimera）即单一个体身上同时具有两套核DNA序列。古代埃及曾经设想过有1种人，其身强力壮像个狮子，但他又是一个疾恶如仇、劫富济贫的好人。这个人有狮子的基因，又有人的基因。这当然是一种丰富的想象。但是，现代科学也发现同一个人具有2套DNA分子，这就是嵌合体现象。例如著名的美国丽迪亚案，她身上有2套独立的DNA系统——其中一套占主导地位，在她的血液和大多数器官组织中。这也是丽迪亚在按常规进行DNA检测时所呈现的图谱；而另一套DNA则只出现在丽迪亚的卵巢中，这套DNA恰好是丽迪亚遗传给其孩子们的DNA。

4．其他外加因素

（1）输血或骨髓移植若某个体近期接受过输入全血，或接受过骨髓（干细胞）移植，则该个体就会出现2个人的混合DNA所表现的STR图谱。

（2）混合检材检材中含有2个人的遗传物质称为混合检材。在2个人的DNA比例接近时，STR基因座的分型图谱就会表现为2个人的。这种混合检材可以是血液－血液混合，唾液－唾液混合，也可以是精液－阴道液混合，或其他类型的体液混合（如羊水与母亲血液的混合物）。