（一）器材清洗与灭菌
微生物的存活环境及其生长繁殖过程所接触到的物品上很多物质对微生物生长繁殖都会产生不良影响，因此，要求检验和培养器材必须彻底清洗干净并进行消毒与灭菌处理。
1.玻璃器材 新采购的或再生性玻璃器皿，进行简单清洗，经酸洗液浸泡，然后冲洗干净，再用蒸馏水荡洗，干燥，灭菌。使用后的器皿清洗，首先进行压力蒸汽灭菌处理，取出立即用水冲洗，再用洗涤机刷洗并冲洗干净和晾干；经酸洗液浸泡2h以上，用自来水冲洗干净，再经蒸馏水荡洗，干燥后包装灭菌。吸管和试管干燥后，吸管在吸口处塞入少许脱脂棉，包装灭菌；试管可用棉塞或纸套密封管口，包装或捆扎后灭菌。
2.灭菌 使用后污染玻璃器材应经压力蒸汽灭菌处理；清洁干燥后的玻璃器材可以用压力蒸汽灭菌，但最好采用干热灭菌，用带鼓风的干热灭菌箱160℃干烤4h。
（二）细菌染色技术
1.革兰染色法
（1）染液：所用染液为草酸铵甲紫，卢格碘液，复红染液。
（2）玻片准备：玻片和载玻片需要经过酸洗液浸泡60min，用自来水冲洗2次，再用蒸馏水冲洗2次；若不干净，可用洗涤机擦洗或用洗衣粉液体煮沸10min，在洗刷干净，用蒸馏水冲洗；进行干燥后备用。
（3）制片：在洁净干燥玻片中央滴少许蒸馏水，用白金耳取少许菌苔或菌液，放到蒸馏水内涂均匀。将涂均匀的玻片上菌膜至室温下晾干或在乙醇灯上略微加热使之干燥。再将干燥处理后的涂菌玻片，有菌面朝外，背向火焰，快速往返3次（经过火焰温度为60℃左右）。
（4）染色：初染，在玻片固定后的菌膜上滴甲紫染液覆盖均匀，1～2min后用水轻轻冲洗。媒染，先用卢格碘液冲洗掉玻片上残水，再用卢格碘液覆盖，1min后用水轻轻冲洗。脱色，从玻片1端滴加95%乙醇，冲洗直至无紫色为止（约30s），再用水洗。复染，滴加复红染液覆盖，2min后水洗。
（5）镜检：首先在低倍镜下找到视野内细菌，然后用油镜观察。菌体呈紫色为革兰阳性菌，菌体呈红色为革兰阴性菌。
2.细菌芽孢染色法
（1）准备：染液为5%孔雀绿水溶液，0.5%复红染液。被检样为含细菌芽孢的标本。玻片清洗、干燥和制片过程与革兰染色法相同。
（2）传统染色法：在1小试管内加2滴蒸馏水，取黏稠的细菌芽孢标本放到管内蒸馏水中并均匀，加3滴孔雀绿染液于小试管内与芽孢标本混合均匀；置于已煮沸的烧杯水中加热20min。从加热染色后试管内取1白金环染色标本置于玻片中央，涂均匀，在乙醇灯火焰上快速通过几次，加热固定。轻轻用水洗脱色，直至流出无绿色为止。复染，用滤纸吸干玻片上水，滴加复红染液覆盖3min，用水轻轻冲洗掉染液，吸干水即可。然后镜检，先用低倍镜找到有芽孢视野，再用油镜观察。菌体呈绿色为芽孢，菌体呈红色为繁殖体。
（3）改良染色法：制片是在洁净干燥玻片中央滴少许蒸馏水，用白金耳取少许细菌芽孢标本，放到蒸馏水内涂均匀，在乙醇灯上背向火焰，快速往返3次略微加热使之干燥并固定。在玻片上覆盖一层结晶滤纸置于平皿内，滴加孔雀绿染液；将其置于50～100℃干热箱内，15min后再加1次染液，总时间30min；用水轻轻冲洗脱色至无绿色为止。复染，用滤纸吸干玻片上水，滴加复红染液覆盖3min，用水轻轻冲洗掉染液，吸干水即可。然后按上述方法进行镜检。
（三）其他微生物染色技术
1.真菌 染色液为乳酸苯酚棉蓝染色液，50%乙醇水溶液。黑曲真菌标本为观察对象。染色过程是首先在处理后的玻片上滴加1滴乳酸苯酚染液，用白金针挑取少量已形成孢子的真菌菌丝，在50%乙醇中浸一下以便洗去脱落的孢子，然后将其放到玻片的染液中涂均匀。盖上盖玻片，即可进行镜检。
2.酵母菌 染色液为0.1%吕氏亚甲蓝染色液和0.05%吕氏亚甲蓝染色液。染色过程是在准备好的干净玻片上加1滴吕氏亚甲蓝染色液，用接种环取少量酵母菌菌苔放在染液中并涂均匀。在涂抹的菌膜上盖1盖玻片，用滤纸吸干盖玻片周遍多余液体。镜检是在高倍镜下观察形态；菌体呈蓝色为死菌，菌体无色为活菌。
（四）细菌接种技术
根据试验目的、培养液种类和培养器皿不同，采用不同接种方法，主要有斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种；固体培养液上接种可分为倾注接种、涂抹接种、划线接种等。
1.接种器材 穿刺接种使用接种针，划线接种用接种环，倾注接种用吸管，涂抹接种用吸管和L棒等。
2.接种方法
（1）斜面接种：固体培养液斜面主要用于细菌和真菌等保种、转种和增菌培养。接种斜面的操作比较简单，一般选择细菌液体标本或菌落，用白金耳蘸取和挑取少许标本划线接种在斜面表面，置于适当温度培养即可。
（2）接种肉汤：液体培养液用于增菌培养，可以单纯为了增菌，也可以是接种纯化菌种制备大量菌液。
（3）倾注接种：用于活菌计数，适合需氧或兼性厌氧菌计数培养。接种方法是取液体样本置于无菌平皿内，立即倒入熔化的固体培养液混匀，尽量使细菌分散成单个菌体，培养长成肉眼可见菌落形成单位，以便计数。
（4）涂抹接种：用于活菌计数和增菌以及培养制备细菌芽孢。接种方法是将细菌液体标本或增菌液用L棒均匀涂抹在固体培养液表面，若标本中菌数较少，就会长成单个菌落形成单位，进行细菌计数；若菌液标本含菌量很高，会在固体培养液表面长成厚厚一层菌苔，此可作为增菌，也可作为细菌芽孢培养的方式。
（5）穿刺接种：用于保存菌种或诊断性培养。方法是用白金针蘸菌标本，直接刺入试管中固体培养液深部，可以保存厌氧菌种，也可以让某种细菌在这种特殊环境中生长出特别形状，一辨别某些种类。
（五）活菌计数技术
活菌计数是指对细菌存在的物质中活菌进行计数，通常以每克或每毫升待检物质作为计量单位。细菌是单细胞生物，直接进行计数非常困难，比较容易操作，且计数比较准确的方法是平板菌落计数法。该方法是以平板上形成的菌落数为基础，即每一个菌落（菌落形成单位clony forming unit，cfu）代表1个细菌，但并非所有菌落都是1个细菌形成，如菌链、菌团未彻底分散或双球菌、四链球菌、八叠球菌等。
1.计数方法 主要方法有直接计数法、稀释计数法、称重法、比浊法等。下面主要介绍消毒试验中常用的稀释平板计数法。其原理是利用整倍数递减稀释，将高浓度细菌培养物均匀悬液或由定量固体制成的悬液稀释至每毫升含菌数50～300个，然后取样01～1.0ml，接种平板，培养形成单个菌落单位，进行计数。
2.操作步骤
（1）制备待检样本悬液。
（2）稀释：取无菌试管排成系列，分别编号10－1、10－2、10－3……，使末管每毫升含菌数为50～300个；分别在各管内加入稀释液，根据稀释倍数加入4.5ml，5倍稀释可加入4.0ml，对倍稀释可加入2.0ml；然后从混匀后的菌悬液原液中取出0.5ml加入到到10－1管内4.5ml稀释液内混匀后，再取4.5ml加入到10－2管内4.5ml稀释液内，依次类推直至末管；5倍稀释取1.0ml加到4.0ml管内，2倍稀释取2.0ml加到2.0ml管内等。
（3）接种：①倾注接种法，从稀释末管内取出0.5ml接种到无菌平皿内，然后倒入16～20ml溶解营养琼脂培养液，混匀，凝固后培养；1个稀释度接种2份，如果对原液菌数估计不足，可接种末位3个稀释度；②涂抹接种法，从末位稀释管内取0.1ml稀释液接种到平板上，用无菌玻璃L棒将接种物均匀涂抹到整个平板直至涂抹干，接种2份，然后培养。
（4）计数：对培养后的平板上菌落进行直接计数，记录下每个平板上菌落形成单位数。
（5）计算：计算出每个稀释度平板平均菌落形成单位数，计数必须在平板间和稀释度间误差允许范围；计算出原液细菌总数，将末位稀释度平板上平均菌数乘以稀释倍数即得出原液细菌总数。
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