本实验根据小鼠腹肌的解剖位置及结构特点，应用腹肌称植性EAC肿瘤模型，采用透明标本的方法固定、显示血管，以期了解肿瘤血管的形成特点及其与肿瘤的关系。
【材料与方法】
1．材料
（1）动物：体重18～22g昆明小鼠，雌雄各半，共20只。
（2）荷癌种鼠：腹腔接种EAC细胞的昆明小鼠。
（3）器械与仪器：小鼠固定板、1ml注射器、试管及肝素管、载玻片、眼科手术剪、显微外科手术剪及手术镊、小三角针、1－0丝线、眼科持针器、玻璃平皿、光学显微镜、BH－2型Olympus日本产显微观测及摄影系统。
（4）试剂：瑞特染液，0．2%台盼蓝生理盐水液，Hank液，脱毛剂，1%戊巴比妥钠溶液，10%甲醛溶液，70%、80%、90%、95%及100%的叔丁醇溶液，水杨酸甲酯。
2．方法
（1）EAC细胞悬液（6．0×107／ml）制备：无菌抽取接种7～9d的荷癌种鼠腹水于无菌试管内，另取少量于肝素内作细胞计数用，周围均置冰块保存。将空针中剩余腹水滴于载玻片上，推片、瑞特染色后进行细胞分类计数用，其中癌细胞应≥95%（若不足应别选种鼠）。再取肝素管内腹水用生理盐水稀释10倍及100倍后，各取0．95ml加0．2%台盼蓝生理盐水液0．1ml，混匀，用白细胞计数法计瘤细胞总数及死瘤细胞数，计算其活率，应≥95%（若不足应别选种鼠）。最后将试管内腹水用无菌预冷的Hank液稀释至浓度6．0×107／ml，为接种时用。
（2）接种于腹膜：将提前2d及脱毛剂脱净腹毛的小鼠用1%戊巴比妥钠（0．3mg／10g体重）腹腔注射麻醉后，仰位固定于鼠板上，并消毒腹部皮肤，然后自剑突下约1cm正中剪开皮肤约1．2cm长，并轻柔细致地向一侧钝性分离，可看见该侧腹肌，寻找血管稀少区，在腹肌内接种6．0×107／ml浓度的EAC细胞悬液0．04ml，可呈现一较饱满小“皮丘”且不塌陷，说明未穿透腹膜，接种部位正确。最后缝合皮肤，并隔离保护至动物安全清醒。
注意：在接种过程中，应将盛有癌细胞悬液的试管始终置于冰块中以保证其存活率不变，并要求操作尽量快而稳。
（3）分组及透明标本的制作：接种好的20只小鼠按每组2只随机分成10组。自接种后第1天开始，每天脱颈椎处死一组制作透明标本。具体制作过程如下。
将处死后的小鼠置入10%甲醛溶液内固定24h。取出，剪开皮肤，剥离下整个腹肌膜，经蒸馏水漂洗1min后依次置入不同浓度的叔丁醇（70%、80%、90%、95%、100%）中脱水6～8h，最后直接放入水杨酸甲酯中至组织完全透明。
（4）观察及拍摄肿瘤血管：用BH－2型Olympus显微镜观察放在盛有水杨酸甲酯的小平皿中的透明标本，注意瘤组织周围及瘤内新生微血管的形态、数量及分布。然后进行显微拍照，用Olympus微循环显微摄影系统观测新生微血管流速。
【实验结果】
接种后第1天，接种区内无新生血管长入，其周围原宿主微血管有轻微渗出现象。第2天，瘤细胞团增大，可见由原宿主微血管发生纤细、弯曲走行的新生血管进入肿瘤，瘤内亦见不连续性血管段。第3～4天，瘤组织进一步长大，瘤外的新生血管密度增加，管径不规则，排列紊乱；瘤内见明显顺肌纤维方向走行的不连续、不完整且分布不均匀、粗细不等的新生血管，有的呈逗点状或芽状，且血管间可由不规则芽状血管连接。第5～6天，肿瘤进行性生长，瘤外微血管纡曲、扩张或呈簇集状分布且粗细不均；瘤内血管开始相互交织或呈窦状不规则扩张。第7～8天，肿瘤内呈现出红色样。瘤外微血管扩张、纡曲、形态各异；瘤内除见少数不连续性短小血管散在不规则分布外，已看不清血管形态，大都融合成片状或团块状。至第9～10天，瘤内仅见相互融合成团块状的红色区带，中心部可见褐色出血坏死区，部分区域可分辨出极度扩张及外观变形的血管。
通过小鼠腹肌移植肿瘤模型，可以较直观观察从接种后第1天就出现的刺激血管生长的“炎症”样变化到以后逐渐形成的肿瘤血管，反映了肿瘤新生微血管的形成特点及其与肿瘤的关系，即肿瘤新生微血管普遍表现为走行弯曲、排列紊乱、管径不规则、缺乏连续性和完整性，甚至呈逗点状或芽状等分化幼稚和发育不成熟的特点。其与肿瘤的关系表现为随接种区内新生微血管的形成和长入，瘤细胞团不断增殖扩大。同时，进行性生长的肿瘤块使中央部血管压力增高、扩张、坏死，表现为融合团块状的红色出色样改变。
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