吸光光度法基本理论

11．1．1 朗伯－比尔定律

1．朗伯－比尔定律的表达式

当一束平行单色光通过有色溶液时，若没有反射和散射，则一部分光被溶液吸收，而另一部分光则透过溶液 （见图11－1）。

设入射光强度为Io，透过光强度为I，定义吸光度A为：

图11－1 浴液对光的作用示意图

实验发现，在待测溶液浓度c一定的条件下，吸光度A与液层厚度b成正比：

A＝K1b

此式是朗伯 （Lambert）定律的表达式。实验还发现，在液层厚度b一定的条件下，吸光度A与待测溶液浓度c成正比：

A＝K2c

此式是比尔 （Beer）定律的表达式。结合以上两式，可得：

A＝Kbc

即吸光度A与液层厚度b和溶液浓度c的乘积成正比。上式便是朗伯－比尔定律的表达式，也是吸光光度法定量分析的依据。

A＝Kbc中的比例系数K称作吸光系数。当c的单位是mol／L、b的单位是cm时，令ε＝K，称作摩尔吸光系数，则：

A＝εbc

其中，ε的单位是 （cm·mol／L）―1。式A＝εbc是朗伯－比尔定律最常用的形式。

2．朗伯－比尔定律的使用条件

朗伯－比尔定律的使用条件是入射光是单色光，没有反射和散射。

若溶液是均相的，则可以满足没有散射的条件。在实际测定时，一般存在反射，但可用参比溶液加以消除。

3．摩尔吸光系数ε的性质

影响ε的因素有吸光物质的性质、实验温度、溶液介质的状况和入射光的波长λ。由于ε受λ的影响，ε可看作是λ的函数，即：

ε＝f（λ）

ε的物理意义是在c＝1 mol／L，b＝1 cm的条件下，ε＝A。因此，ε是溶液在单位浓度 （c＝1 mol／L）、液层在单位厚度 （b＝1cm）的条件下待测溶液的吸光度。

ε可作为测定灵敏度的标志：一定条件下，ε越大，则A越大。所以，ε可以作为一定条件下吸光物质对光的吸收能力大小的量度；也可作为一定条件下测定灵敏度的标志， ε越大，灵敏度越高。

4．透光度的概念

透光度 （也称透光率或透射比）T的定义为透过光强度I与入射光强度Io的比值：

则吸光度A与透光度T的关系如下：

以透光度表示的朗伯－比尔定律为：

－lg T＝εbc

透光度也可以百分透光度T（％）表示：

按吸光度与透光度的关系式A＝l g＝－lg T，仪器显示的吸光度与透光度标尺的关系如图11－2所示。

图11－2 A与T的关系示意图

5．吸光度的加和性

若溶液中有n种组分对某一波长的光有吸收，则该波长处测得的吸光度A应是这n种组分的吸光度Ai（i＝1，2，…，n）之和，即：

式中，A是测定波长处总的吸光度，Ai是测定波长处第i种组分的吸光度，εi是测定波长处第i种组分的摩尔吸光系数，ci是第i种组分的浓度。此式也是测定波长处有n种组分产生吸光度的朗伯－比尔定律的表达式。

11．1．2 吸收曲线和最大吸收波长

1．吸收曲线和最大吸收波长的概念

在溶液浓度、液层厚度一定的条件下，改变入射光波长λ，测定溶液的吸光度A，以A对λ作图，得如图11－3所示的吸收曲线。在图11－3中，最大吸光度对应的入射光波长称为最大吸收波长，记作λmax。

2．吸收曲线和最大吸收波长的作用

（1）初步定性

不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长一般是不同的，吸收曲线和最大吸收波长可以作为定性分析的依据。但可见光范围的吸收曲线往往比较简单，不能排除不同物质有相同或相似的吸收曲线和最大吸收波长的可能，因此吸收曲线和最大吸收波长一般只能用作初步定性。

（2）为选择入射光提供依据

在λmax处，吸光度A最大，摩尔吸光系数ε也最大，若在此波长处进行测定，则灵敏度最高。如果不考虑其他组分的干扰，通常可以λmax作为入射光波长。

图11－3 吸收曲线示意图

图11－4 标准曲线示意图

11．1．3 定量方法

1．标准曲线法

在入射光波长、液层厚度等实验条件一定的情况下，测定一系列已知浓度为c的标准溶液 （这类标准溶液也称校准溶液）的吸光度A，按朗伯－比尔定律：

A＝εbc

并以A为纵坐标，c为横坐标作图，得图11－4所示的标准曲线 （也称校准曲线或工作曲线）。在相同条件下测定待测溶液的吸光度，可从标准曲线上查出待测溶液的浓度。

标准曲线法也称校准曲线法。

2．直接比较法

在实验条件一定的情况下，测得浓度为cs的标准溶液的吸光度为As，按朗伯－比尔定律有：

As＝εbcs

在相同条件下，测得浓度为cx的待测溶液的吸光度为Ax，同样有：

Ax＝εbcx

比较以上两式，可得：

由此可求出待测溶液的浓度。

直接比较法的误差一般大于标准曲线法，吸光光度法定量分析通常采用标准曲线法。使用直接比较法时，更应注意控制实验条件，并采用与待测溶液浓度相近的标准溶液。

11．1．4 对朗伯－比尔定律的偏离

按朗伯－比尔定律，标准曲线应是直线，但在实际测定中，标准曲线有时会发生弯曲（见图11－5），这种现象称作对朗伯－比尔定律的偏离。

图11－5 对朗伯－比尔定律的偏离示意图

引起偏离的原因及消除偏离的方法主要针对以下四个方面。

1．入射光非单色光引起的偏离

入射光必须是单色光，这是朗伯－比尔定律的使用条件之一，这是因为摩尔吸光系数ε是入射光波长λ的函数，只有当λ一定时，ε才能保持常数，标准曲线才能保持直线。但目前使用的仪器提供的入射光并非真正的单色光，而是由比较小的波长范围的复合光构成的所谓的 “单色光”，由此可能引起对朗伯－比尔定律的偏离。

有两种方法可以消除由于入射光为非单色光而引起的偏离：第一，选择性能较好的单色器，从而可以用纯度较高 （波长范围较小）的 “单色光”作为入射光。但这往往受到实验室现有仪器条件的限制。第二，选择吸收曲线较平坦部分对应波长的光作为入射光。因为吸收曲线较平坦，说明ε随λ的变化较小，当以这部分波长的复合光作入射光时，对朗伯－比尔定律的偏离也比较小。在最大吸收波长λmax处的吸收曲线往往比较平坦，一般可选择λmax作为入射光波长。这样，不仅消除或减少了因仪器无法提供真正的单色光而引起的对朗伯－比尔定律的偏离，而且使测定的灵敏度提高到最大。

2．介质的不均匀引起的偏离

待测溶液必须是均相的，不能有乳浊物或悬浊物的存在。因为朗伯－比尔定律要求待测溶液对光没有散射，而当有乳浊物或悬浊物存在时，会产生光的散射，引起光的损失，从而对朗伯－比尔定律产生偏离。

因此，测定时应避免溶液中存在乳浊物或悬浊物。

3．化学因素引起的偏离

溶液条件 （如温度、酸度、溶液中共存的其他试剂的组成和浓度等）的变化，有可能使待测组分的存在形式发生变化，从而引起摩尔吸光系数的变化，对朗伯－比尔定律产生偏离。如Fe3＋易与低浓度的显色剂SCN－形成Fe（SCN）2＋，与高浓度的SCN－形成Fe（SCN）3，而Fe（SCN）2＋与Fe（SCN）3的摩尔吸光系数是不同的；再如在碱性溶液中， Cr（Ⅵ）以Cr O42－的形式存在，在酸性溶液中，以Cr2O72－形式存在，而Cr O42－与Cr2O72－的摩尔吸光系数也是不同的。

因此，测定时应注意保持相同的溶液条件，从而保证待测组分的存在形式是一定的。

4．溶液浓度变化引起的偏离

对朗伯－比尔定律而言，溶液浓度的变化不会引起标准曲线的弯曲，但当溶液浓度发生较大变化时，吸光物质 （分子或离子）之间的距离会发生较大的变化，分子间的相互作用也发生较大的变化，从而可能使吸光物质的吸光能力发生变化，引起摩尔吸光系数的变化，对朗伯－比尔定律产生偏离。

因此，朗伯－比尔定律一般只适用稀溶液。