影响共聚焦图像质量因素

四个主要因素决定了共聚焦图像的质量：①空间分辨率；②光强分辨率；③信噪比；④瞬时分辨率。

空间分辨率是描述图像两点间最小可分辨距离的。沿z轴方向上两点分辨率和图像平面两点分辨率取决于激发波长、荧光波长、物镜的数值孔径和共聚焦扫描头的位置。物镜的数值孔径是至关重要的，因为它决定了扫描样品束斑的尺寸和针孔处共聚焦荧光束斑的尺寸。数值孔径决定空间分辨率的原理前已论述。在共聚焦模式中，激发和发射波长是重要的，在共聚焦光学中可辨的最小距离正比于它们波长的倒数之和。在共聚焦显微镜中，空间分辨率也取决于针孔孔径尺寸、变倍因子和扫描速率。减小针孔尺寸意味着减小了沿z轴方向聚焦面的厚度，因此获得更高的光学截面分辨率，这是高质量投影图像和高分辨三维观察的基础。减小针孔尺寸也改善了图像的衬度，因为失焦光源的光被排除。在某些条件下，共聚焦荧光显微镜在xy平面内的横向分辨率可远高于大视域荧光显微镜，具有超高分辨率。

1995年，韦伯（Webb）给出了共聚焦显微镜x，y水平面内两点分辨率的表达式：

dxy≈0.4λ／NA（6-1）

z轴向分辨率为

dz≈1.4λn／NA2（6-2）

图6-3显示出针孔直径（pinhole diame-ter））对光学截面厚度的作用。针孔尺寸的减小有利于轴向（z方向）分辨率的提高，但损失了水平方向（x，y）的分辨率。

光强分辨率描述了图像中强度的分辨率，它被定义为由模数转换器所赋予图像的灰度数。最大可能的动态分辨率就是探测器的动态分辨率。PMT探测器的动态分辨率被定义为饱和信号与探测器噪声信号之比，它们是以伏特或电子数来计算的。因此，探测器的动态分辨率是一种图像系统的本征特征。为了发挥探测器成像潜能，操作者应尽力获得从黑（无信号）到白（饱和信号）整个动态范围的图像，这可通过调整光学信号的振幅范围来实现。

图6-3 针孔直径对光学截面厚度的作用

信噪比（S／N）定义为图像的可视度。它直接取决于物体和它的背景的振幅，以及成像系统的电子噪声。对于明亮图像，信噪比主要是由物体和它的背景强度所决定的，而对于灰暗图像，图像系统的电子噪声成为决定因素。在针孔处图像亮度是受多因素影响的，包括激光功率、样品中荧光色品密度、物镜的数值孔径、共聚焦倍率因子、光栅扫描速度、荧光滤片组件的选择等。在共聚焦显微镜中，通常改善信噪比的方法是通过降低扫描速率来增加光量。

瞬时分辨率取决于光栅扫描速率和PMT探测器、模数转换器和计算机处理速率。在共聚焦显微镜中，每秒通常能给出2帧512×512像素图像，每秒100帧或更高速率只能实现于有限尺寸的图像。

总之，在共聚焦显微镜中光学性能是受诸多因素影响的。我们不可能对一个确定的样品和显微镜在时间、空间和强度上都同时优化获得。因此，我们必须采取折衷方法。例如，为了优化光强的分辨率从而能获得高信噪比图像，就可能需要减小空间分辨率或图像瞬时分辨率。如何平衡这些参数来获得高质量共聚焦图像，这与操作者的知识和经验密切相关。