反应温度和循环参数

第四节　PCR反应温度和循环参数

PCR反应是一个重复的循环过程，每一循环包括3个阶段的反应，加热而导致模板的变性，变性后寡聚核苷酸与单链靶序列杂交而退火以及由热稳定DNA聚合酶的介导使已杂交的引物的延伸。

1.变性的温度和时间　在PCR反应中，只有当模板DNA和PCR反应产物完全变性成为单链后，引物才能在退火过程中与模板结合，因此，使模板充分变性是PCR反应成败的关键。

变性通过加热来实现，变性所需要的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中G＋C含量，双链DNA中的G＋C比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需要的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的解链温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若解链温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域发生变性，当PCR循环中温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。

2.退火的温度和时间　退火的温度决定着PCR反应的特异性。引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。引物长度越短、G＋C比率越低，所需的退火温度就越低。一般来说，降低退火温度可提高扩增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高退火温度，则可减少引物与模板间的非特异结合，提高反应的特异性，但扩增效率会下降。退火温度确定后，退火的时间并不是关键的因素，但也应加以控制。退火时间过短，会导致延伸失败；退火时间过长，会增加引物与模板间的非特异性结合。

3.延伸的温度和时间　延伸的温度取决于所使用的DNA聚合酶的最适温度，一般延伸的温度设定在所用的DNA聚合酶的最适温度附近，以获得最大的扩增效率。不合适的延伸温度不仅影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。延伸的时间视待扩增DNA片段的长度而定。在最适温度下延伸1分钟对于2kb的扩增片段已经足够，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。

4.循环次数　循环次数决定着扩增的程度。在其他参数都已优化的前提下，循环次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外，还会导致PCR反应“平台效应”的出现。