实验一 临床常见球菌的分离培养及鉴定
一、目的要求
1．掌握葡萄球菌、链球菌、肠球菌、脑膜炎球菌、淋球菌的分离培养和鉴定方法。
2．熟悉葡萄球菌、链球菌、肠球菌、脑膜炎球菌、淋球菌的菌落特点、菌体形态及染色性。
二、实验原理
1．临床常见需氧G＋球菌的鉴定流程如图2－1所示。
2．需氧G＋球菌的属间鉴别。
葡萄球菌属与链球菌的区别：葡萄球菌属触酶实验为阳性，而链球菌阴性；菌体形态链球菌小于葡萄球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球菌。
葡萄球菌属与微球菌的区别：触酶实验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联状，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵实验为氧化型；而葡萄球菌为发酵型。另外呋喃唑酮（即痢特灵50μg/片）敏感实验微球菌为耐药，而金黄色葡萄球菌为敏感。
3．葡萄球菌属的种间鉴定。
（1）色素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色，柠檬色或者淡黄色，而其他葡萄球菌则在血平板上菌落大多数为白色，也有部分为柠檬色或深黄色。
（2）溶血毒素：金黄色葡萄球菌完全溶血，其他葡萄球菌大多数不溶血，表皮葡萄球菌有极少能产生溶血毒素。
（3）血浆凝固酶实验：金黄色葡萄球菌阳性，其他葡萄球菌阴性。
（4）新生霉素敏感实验：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌对新生霉素纸片（5μg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌则对之耐药。抑菌环直径＞16mm即为新生霉素敏感。
（5）甘露醇氧化发酵实验：金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘露醇（即两管都变黄色）；其他葡萄球菌需氧部分产酸，厌氧条件下不利用甘露醇（即没加石蜡管有部分会变黄色，加石蜡管不变黄色）。
图2－1 临床常见需氧G＋球菌的鉴定流程
4．链球菌属的种间鉴定。
（1）乙型溶血链球菌的鉴定。
对杆菌肽（0．04U/片）（抑菌圈直径≥10mm）敏感：A群链球菌（主要为化脓性链球菌）。
对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，但马尿酸钠水解实验﹑CAMP实验阳性：B群链球菌（主要为无乳链球菌）。
对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，马尿酸钠水解实验阴性，CAMP实验阴性：主要为马链球菌﹑类马链球菌﹑兽疫链球菌；对三者的区别实验要加做海藻糖和山梨醇实验。
CAMP实验：将能产生β－溶血的金黄色葡萄球菌在血平板上划一横线接种，再将待鉴定菌于金黄色葡萄球菌3mm处垂直种一短线，若在有CO2条件下培养5～6h，或无CO2条件下培养18～24h，在两细菌连接处出现一个半月形的加强溶血区即为CAMP实验呈阳性。
（2）甲型溶血链球菌的鉴定。
草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣（Optochin）不敏感，胆汁溶菌实验阴性，胆汁七叶苷实验阴性，在高盐中不生长。主要有变异链球菌、轻型链球菌、血链球菌、唾液链球菌等。
肺炎链球菌：菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对，尖端相背，较葡萄球菌小，比其他链球菌略大；在血平板上菌落细小﹑圆形﹑表面光滑﹑灰白色﹑半透明，开始时菌落呈扁平状，以后中心塌陷，呈脐窝状。与草绿色链球菌的主要区别是胆汁溶菌实验阳性，对奥普托欣（Optochin）敏感。奥普托欣（Optochin）含量为5μg/片，抑菌环＞18mm为敏感，＜15mm为不敏感，15～18mm应重复实验。
（3）肠球菌（D群链球菌）的鉴定。
溶血不定，主要是α－﹑γ－溶血；对杆菌肽不敏感，但其特异性实验是胆汁七叶苷实验阳性；若能在6．5%NaCl的心浸液肉汤中生长即为D群肠球菌，不能生长为D群非肠球菌。
5．临床常见需氧G－球菌的鉴定流程如图2－2所示。
图2－2 临床常见需氧G－球菌的鉴定流程
三、实验内容及方法
（一）临床常见球菌的形态观察
1．葡萄球菌、链球菌、肠球菌、脑膜炎球菌、淋球菌的菌落形态观察。
（1）材料。
葡萄球菌、链球菌、肠球菌、脑膜炎球菌、淋球菌的纯培养。
（2）实验方法。
观察各菌在培养基上的生长，包括菌落大小、形态、产色素、溶血等特征。
（3）结果记录及分析。
准确描述各菌菌落形态，并加以比较。
2．葡萄球菌、链球菌、肠球菌、淋球菌的菌体形态观察。
（1）材料。
葡萄球菌、链球菌、肠球菌、淋球菌纯培养物；革兰染色试剂；显微镜；等等。（2）方法。
挑取典型菌落分别制备涂片，自然干燥后固定，革兰染色，油镜镜检。
（3）结果记录及分析。
观察各菌的染色性、大小、形态、排列、有无荚膜等，绘图。
（二）常用的生化反应及各种菌的鉴别
1．触酶（过氧化氢酶）试验（鉴别葡萄球菌属和链球菌属）。
某些细菌具有过氧化氢酶，能分解过氧化氢产生水，并释放出初生态氧，生成氧分子而出现气泡。
（1）菌种。
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌。
（2）方法。
无菌挑取固体培养基上的待检菌落，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢溶液数滴，立刻观察有无气泡产生。注意挑取血培养基上的菌落时不要碰到血培养基。
（3）结果记录及分析。
于10s内有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。记录各菌的触酶试验结果，分析是否能加以鉴别。
2．血浆凝固酶试验（鉴别葡萄球菌的致病性）。
金黄色葡萄球菌能产生结合型血浆凝固酶（凝聚因子），可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝块；游离型的血浆凝固酶则可使试管中血浆发生凝固。表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌则不产凝固酶。血浆凝固酶试验常作为鉴定葡萄球菌致病性的主要依据之一。
（1）菌种。
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。
（2）方法。
玻片法测结合型凝固酶：取1滴用EDTA抗凝的兔血浆于洁净玻片的一端，另一端加1滴生理盐水作为对照。用接种环挑取待检菌置于生理盐水中，混匀使成菌悬液；然后取1环菌悬液加入血浆中混匀，10s内观察结果（超过10s可能会出现假阳性）。
试管法测游离型凝固酶：取3支Φ10×100mm试管，各加0．5mL新鲜兔血浆（EDTA抗凝），在其中1支试管中加3～5个待检菌菌落，充分碾磨混匀使菌悬液呈牛奶样浑浊，另2支试管中分别加凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌菌株和凝固酶阴性的表皮葡萄球菌菌株作对照，置35℃大气环境中4h，观察结果。
（3）结果记录及分析。
玻片法：血浆中出现明显的细菌凝块而对照的生理盐水中不出现凝块的为血浆凝固酶阳性；两者都不出现细菌凝块的为阴性。生理盐水中如果出现凝块，说明待检菌出现自凝。
试管法：若4h内试管中出现明显的纤维蛋白凝块、倾斜试管其中的凝固物不移动，则为阳性；反之，试管内血浆不凝固仍流动的，为阴性。
记录各菌的凝固酶试验结果并加以分析。
3．甘露醇发酵试验：（鉴别金黄色葡萄球菌）。
致病性葡萄球菌大多能发酵甘露醇产酸，使培养基由紫色变为黄色。
（1）菌种。
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。
（2）方法。
将待检菌分别接种至甘露醇发酵管中，35℃培养箱中培养18～24h后观察结果。
（3）结果记录及分析。
培养基浑浊、由紫色变为黄色者为甘露醇发酵试验阳性；仍为紫色者为阴性。
记录各菌的试验结果并加以分析。
4．杆菌肽敏感试验（用于鉴别A族链球菌）。
A群化脓性链球菌对杆菌肽几乎100%敏感（杆菌肽0．04U/片，抑菌圈直径≥10mm），而其他链球菌对杆菌肽通常耐药。故可对A群化脓性链球菌进行鉴别。
（1）菌种。
乙型链球菌、无乳链球菌。
（2）方法。
挑取待检菌，密集涂布于血平板上，用无菌镊子夹取杆菌肽纸片贴于新接种的血平板上，35℃培养箱中培养18～24h，二氧化碳环境中培养效果更佳。观察结果。
（3）结果记录及分析。
观察纸片周围有无抑菌圈；测量抑菌圈直径。判断待检菌对杆菌肽敏感还是耐药，分析待检菌是A群化脓性链球菌的可能性。
5．Optochin敏感试验（鉴别肺炎链球菌）。
Optochin（乙基氢化羟基奎宁）能干扰肺炎链球菌叶酸合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对Optochin敏感。
（1）菌种。
甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌。
（2）方法。
挑取待检菌，密集涂布于血平板上，用无菌镊子夹取Optochin纸片（5μg/片）贴于新接种的血平板上，35℃，培养5%二氧化碳环境中培养箱中培养18～24h。观察结果。
（3）结果记录及分析。
观察纸片周围有无抑菌圈；测量抑菌圈直径。判断待检菌对Optochin敏感还是耐药；分析待检菌是肺炎链球菌的可能性。
6．胆汁溶菌试验（鉴别肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌）。
胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自溶酶，促进细菌细胞膜破损或菌体裂解而自溶。
（1）菌种。
甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌。
（2）方法。
平板法：在血琼脂平板上选择出待检的已培养18～24h的单个草绿色溶血的菌落，观察记录菌落特点，然后于菌落上加一滴100g/L去氧胆酸盐溶液，35℃大气环境中孵育30min后观察结果。
试管法：将甲型链球菌和肺炎链球菌血清肉汤培养液1mL分别加入2支试管，再于各管中加入20g/L去氧胆酸钠溶液0．1mL，摇匀后置35℃水浴30min后观察结果。
（3）结果记录及分析。
平板法若菌落消失为阳性，菌落不消失为阴性。试管法若液体由浑浊变透明为阳性，菌悬液仍浑浊为阴性。
记录各菌的试验结果并加以分析。
7．胆汁七叶苷试验。
培养基中的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌和D群链球菌都能在含有胆盐的培养基中生长并水解七叶苷，生成七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁反应形成黑色沉淀，使培养基变黑色。可用于鉴定肠球菌，但不能区分肠球菌和D群链球菌。
（1）菌种。
肠球菌、无乳链菌。
（2）方法。
挑取待检菌，分别接种至胆汁七叶苷培养基中，35℃培养箱中培养18～24h，观察结果。
（3）结果记录及分析。
细菌生长，且培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。记录待检菌的试验结果，分析待检菌是否可能是肠球菌。
四、思考与讨论
1．如何鉴定金黄色葡萄球菌？
2．胆汁七叶苷试验不能区分肠球菌和D群链球菌，如何将此两菌进行鉴别？
3．常见G－球菌有哪些？如何鉴别？
4．肺炎链球菌的鉴别要点有哪些？
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