奇异的无公害农药

6　奇异的无公害农药——苏云金杆菌

有人预测，21世纪对人类最大的威胁不是战争，不是饥荒，而是生态环境的恶化。鉴于此，保护生态环境已成为21世纪全人类面临的中心问题之一，并已受到全人类的高度重视。早在1992年，联合国在巴西召开的“世界环境与发展大会”，就有183个国家参加，102位国家元首出席，被人们称为“地球首脑会议”。这次盛况空前会议形成了一个重要决议，核心是保护环境和生态不受破坏，资源可持续利用。决议中指出，在全球范围内控制化学农药的销售和使用，同时将不断提高无公害生物农药的产量。我国也将“绿色食品和生物农药的发展”列入了“中国21世纪议程”，“十一五”期间，国家又提出“绿色植保”理论，禁止使用高毒农药。

在众多的生物农药中，研究最多、产量最大、应用最广的是苏云金芽孢杆菌，其制剂也是唯一能与化学农药竞争的生物农药，它是生物农药家族中最重要的成员，也是害虫生物防治大舞台上的主要角色。

苏云金芽孢杆菌是何物呢?它是一种微生物细菌，个体非常小，只能在显微镜下才能看得见，确切地说是一种产生伴胞晶体的芽胞杆菌。它的发现已有100多年的历史。首次发现这种细菌的是日本学者石渡，他于1901年从病死家蚕中分离出这种细菌，当时将其命名为摔倒杆菌。到1911年，德国学者伯莉纳(Berliner)从德国苏云金地区一家面粉厂的地中海粉斑螟病虫中，也获得了这种细菌，并于1915年定名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。从此，这类细菌就被称为苏云金芽孢杆菌。

苏云金杆菌与芽孢杆菌中的其他几个兄弟长得很相似，如蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌以及蕈状芽孢杆菌等有着许多相同或相近的特性，长期以来，苏云金芽孢杆菌与几位孪生兄弟的分类地位就一直有着激烈的争论，众说纷纭，莫衷一是，直到1957年的《伯杰细菌鉴定手册》才将苏云金芽孢杆菌定为一个独立的种，收编入册，使它真正有了自己的名字。它的重要特点是含有伴胞晶体，而且对昆虫有致病性。到1974年，《伯杰细菌鉴定手册》将苏云金芽孢杆菌又派生出几个孪生兄弟，称之为亚种。

苏云金杆菌虽然个体微小，要借助显微镜才能观察到，但它的形态不是单一的，而是在不同的生长阶段显示不同的形态。它主要分为三个生长阶段，第一阶段是营养体阶段，这时身体为杆状，宽度为1～1.8微米，长度为3～5微米，杆菌两端为纯圆纯，有的周身长满鞭状长毛，能在液体培养基或水中运动，有的则没有鞭毛;有的为单体，有的是两个连在一起，有的4个连在一起，有的是8个连在一起，还有的连成很长的长链。

第二阶段是芽孢体阶段，此阶段菌体内一端形成芽孢，就像一个袋子的一端发了芽，另一端形成伴孢晶体，外形无变化。

第三阶段为伴孢晶体、芽孢脱落阶段，此阶段芽孢体破裂，装东西的“袋子”破了，晶体、芽孢游离出来。这些伴孢晶体呈现不同的形态，变化多端，多数为菱形，有的为方形、球形、多边形、三角形、镶嵌形成不规则形等，同一菌株可能形成多种形态的伴孢晶体，伴孢晶体由杀由晶体蛋白组成，它们可以占到细胞干重的25%～30%左右。芽孢呈卵圆形，宽度为0.8～0.9微米，长度为2～4微米(见图15)。为了观察它的真实长相，常用方法是，将制好的样本经过一种叫做石炭酸复红的化学试剂简单染色，然后用光学显微镜进行油镜观察，这些微生物原形毕露，此时，伴孢晶体或营养体呈红色，芽孢不着色，但能显出卵圆形的轮廓，形状象鹅蛋，胖墩墩的。

图15　苏云金芽孢杆菌的芽胞囊

(放大倍数:2680箭头所指:伴孢晶体S代表:芽孢)

相比之下，苏云金芽孢杆菌菌落特征的观察要简便得多。当然，首先我们要明确什么是菌落，所谓菌落是指在固体培养基表面，由单个菌体增殖汇聚成大兵团。单个菌体为一滴水，汇聚成菌落就像一个湖，也像人一多就能组成一个大的阵容一样，所以菌落是可以用肉眼观察到的。苏云金芽孢杆菌的菌落特征在不同培养基上存在着差异，这就像“八阵图”，在不同的环境中，摆布不同的阵容，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，菌落呈园盘状，有的边缘较整齐，有的呈毛状、锯齿状。培养1天左右表面呈湿蜡状，灰白色，无光泽;培养3天以上呈干蜡状，乳白色，有光泽，有的表面有皱纹。在其他培养基上又会布另外的阵容，出现其他形状的菌落(见图15)。

苏云金芽孢杆菌的分布非常广泛。它作为一种昆虫病原菌，也算是一个大家族，可以从世界各地采集的多种病死昆虫、不同的土壤、贮藏物仓库尘埃、蚕渣、污泥、植被等昆虫接触物中分离到。据调查，苏云金芽孢杆菌在全球有着广泛的分布，其中，在亚洲的分布是最丰富的。而在亚洲，我国又是最丰富的国家。我国的研究者已从我国采集病死昆虫及土壤样本中分离到2 000多株。在全球范围内所获得的苏云金芽孢杆菌菌株已超过4 000株，并划分为71个血清型，87个亚型;杀虫晶体蛋白基因划分为68大类，530亚类。如此丰富的苏云金芽孢杆菌资源，真是害虫的克星，人类的福音，只是有待于我们去开发。

世界上的第一个苏云金芽孢杆菌商品制剂是1938年在法国问世的，我国的第一个苏云金杆菌商品制剂则是1965年在武汉投产的。目前，世界上已有的苏云金芽孢杆菌商品制剂120多种，产量和品种还在逐年增加。在生物农药的销售上，苏云金芽孢杆菌的销售额占了90%左右，成为唯一能与化学、农药进行竞争的生物农药。

苏云金芽孢杆菌制剂的生产方式就像工业化做米酒一样，主要是采用液体深层发酵，这种发酵是在一种特制的发酵罐中进行，并伴随着通气和搅拌。这种方式又被称为“洋法”生产，其特点是:发酵周期短、发酵条件容易控制、产量大等。不过，这种生产方式的投资较大。此外，还有一种半固体发酵的生产方式，这种生产方式有点类似于我国传统的“制曲”技术，又被称为“土法”生产。其特点是:生产设备少、工艺简单、投资少、见效快，不足之处是产量较低，发酵条件有时不易控制。

长期以来，用于苏云金芽孢杆菌制剂生产的菌株，都是采用从自然界分离筛选的高毒力天然菌株。不过，近些年来，在生物工程高科技的发展中，已经利用基因工程技术，人工构建了工程杀虫菌，并将这些人造菌株用于杀虫制剂的生产。这类杀虫制剂具有毒力强、杀虫范围广及残效期长、成本低又具安全性等特点。

随着研究工作的不断深入，苏云金芽孢杆菌已成为一种新型杀虫武器。其杀虫范围正在迅速扩大。到目前为止，发现苏云金芽孢杆菌的杀虫范围已覆盖无脊椎动物中的4个门，即节肢动物门、线形动物门、原生动物门和扇形动物门。在节肢动物门中，包括有鳞翅目、双翅目、鞘翅目等9个目中的600多种有害生物。有趣的是，随着研究的深入，研究者们还发现了对癌细胞有特异毒杀作用，而对正常的细胞无毒杀作用的苏云金芽孢杆菌菌株。

面对众多农作物害虫防治对象，苏云金芽孢杆菌大有用武之地。那么，苏云金杆菌又是如何发挥它的威力，引起害虫疾病、使害虫致死的呢?研究发现，苏云金杆菌对敏感害虫的感染，主要是由于苏云金杆菌的伴孢晶体对害虫的胃毒作用引起的。当这些害虫连同食物一起吞食伴孢晶体后，伴孢晶体会被中肠碱性肠液溶解，再经蛋白酶作用后成为有活性的蛋白质毒素，这种毒素可以与中肠上皮细胞的特殊的部位结合，随后在细胞膜上形成孔洞，引起害虫肠道发生溃烂，最后导致害虫停止进食而死亡。有些害虫同时蚕食伴孢晶体和芽孢后，尽管芽胞在pH 9以上的消化液中不能萌发，但是，由于晶体毒素造成的肠管损伤会引起微酸性体液，从而使pH值降低，使芽胞能够发芽增殖。这些增殖的营养体从肠管损伤部位侵入血腔，并进一步增殖，引起昆虫败血症及全身瘫痪而死亡。

此外，有些苏云金芽孢杆菌的菌株，还能产生其他生物活性物质，如苏云金素、双效菌素、几丁质酶、营养期杀虫蛋白、肠青素等。这些生物活性物质，有的能独立发挥杀虫作用，有的能胁助、加速或增强晶体蛋白的杀虫作用。

目前，苏云金杆菌已广泛地用于防治农业、林业、果树、贮藏物及卫生害虫，防治效果非常好，已获得显著的经济效益、社会效益和生态效益。除了应用苏云金芽孢杆菌制剂防治害虫外，经遗传改良，构建的防效高、成本低、又具安全性的实用型的生物工程杀虫制剂也开始被用于防治害虫。此外，利用基因工程技术，将苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因导入植物，获得了一些防虫的转基因植物，如烟草、蕃茄、玉米、土豆、棉花、水稻及白云杉等等。其中，防虫的转基因烟草、番茄、棉花及水稻等已进行大面积应用，并获得了显著的防虫效果。我国在防虫转基因棉花及水稻等作物的研究开发中，作出了显著成效。转杀虫基因的棉花新品种已于1999年进行商业化生产，2009年种植面积达到380多万公顷，占我国棉花种植面积的70%，从而使我国成为独立自主研制成功抗虫棉的第二个国家。我国转杀虫基因水稻所获得的新品种，可使水稻单产增加8%左右，农药施用量减少80%以上，2009年，这种新品种获得了农业部颁发的转基因生物生产应用安全证书，并被国际农业生物技术应用服务组织誉为“是一项里程碑式的决策”。