选择标记基因的清除

抗性标记基因有助于转化细胞筛选，但并不参与植物性状的改良，在得到所需要的转化植株后，选择标记基因成为多余，甚至可能有害。转化时使用选择标记基因的，转基因植株再生成功后，其释放大田前剔除选择标记基因。目前剔除转基因植物选择标记基因的方法主要有4种：共转化法、转座子系统、位点特异性重组酶系统和同源重组系统。

1）共转化剔除标记基因

选择标记基因和目的基因分别位于不同的T-DNA区，通过农杆菌介导法将两个T-DNA引入植物基因组中，共转化植株在筛选完成后经过后代遗传分离即可获得无选择标记的转基因植株。这是一种较简单的去除选择标记基因的转化系统。目前已报道的主要有以下3种（见图7.12）：

图7.12　3种共转化方法

（1）双质粒/双菌株系统［见图7.12（a）］。两个农杆菌菌株分别含有携带目的基因和选择标记基因的质粒，将两种菌株与植物受体细胞共培养，可获得目的基因与选择标记基因的共转化植株，再通过后代有性繁殖过程使两者得到分离。

（2）双质粒/单菌株系统［见图7.12（b）］。同一农杆菌菌株含有分别携带目的基因和选择标记基因的质粒，共转化植株通过后代有性繁殖过程使两者得到分离。在实际应用中，这两种方法的共整合频率往往较低。

（3）双T-DNA系统［见图7.12（c）］。为了克服以上两种转化系统的弱点，可以将选择标记基因和目的基因分别插入到同一质粒的两个相互独立的T-DNA区内，构建含有两个T-DNA区的农杆菌超级双元载体（super列之间，T-DNA区同时包含CaMV 35S启动子驱动的Ac转座酶基因和hph。将此植物载体转化水稻，得到68株转基因植株。通过分子鉴定得出Ds-cry1B片段删除和重新插入的比例分别是37%和25%。

这种转座效应不仅可以剔除标记而且可使目的基因组不同位置以不同水平表达。转座子途径可以不需要再次转化或杂交引入重组酶。但是该途径也存在一定弊端，如效率较低，转座子切除有时并不是精确切除，可能会改变周围基因的结构；转座后往往偏向原来附近位置重新插入；需要有性分binary vector，SBV）。获得的转基因植株经过后代有性繁殖过程后，目的基因与选择标记基因会发生分离，从而获得只含有目的基因而不含有选择标记基因的转基因植株。

2）转座子途径剔除标记基因

转座子是指一段特定的DNA序列，它可以在染色体组内移动，从一个位点切除，插入到一个新的位点。由于转座元件有3个主要特性，因而可以利用其获得无标记基因转基因植株：①玉米转座元件如Ac/Ds在异源植物寄主中可以转座至连锁或非连锁位点；②转座元件中转座酶可以在非转移部位表达，而转座部位只需要携带其转座的末端序列；③转座后有时没有重新插入，可能是因为转座原件的丢失。

转座子系统将选择标记基因或目的基因和转座子相连，在转座子和标记基因或目的基因一起移动的过程中，标记基因与目的基因分离或丢失。从玉米中得到的转座子系统Ac/Ds，被多次应用于植物转基因中。Cotsaftis等（2002）构建了植物双元载体，将在玉米ubiquitin启动子驱动下来源于Bacillus thuringiensis的cry 1B，置于玉米Ac/Ds转座子系统的末端重复序离途径，只适用于有性繁殖以及生活周期短的植物。这些限制了其在标记剔除策略上的应用。

3）位点特异性重组系统剔除标记基因

位点特异性重组是通过重组酶作用在DNA专一性位点间实现同源交换，重组是双向的，可以把外源基因整合到染色体上，也可以从染色体上把外源基因切除。该反应系统由重组酶及其识别位点组成，当两个识别位点正向排列时，重组酶催化两位点之间序列的切除。目前应用于植物遗传转化的重组酶系统有：大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox系统、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2μm质粒的FLP-FRT系统、接合糖酵母（Zygosaccharomyces rouxii）的pSR1质粒的R-Rs重组系统、链霉菌属噬菌体ΦC31的位点特异性重组系统和Mu噬菌体的Gin重组系统。

这些系统的共同特点是在带剪切的序列即标记基因两侧有重组酶特异识别的正向重复序列，重组酶与特异序列相互作用促使特异序列之间重组，从而将标记基因从基因组上切除。在一些转基因整合模式复杂的植物中，利用位点特异性重组更有意义，在去除标记基因的同时也可以获得单拷贝的转基因植株。

4）同源重组剔除标记基因

同源重组在理论上就是在没有重组酶活性的情况下，将标记基因置于重复序列之间，通过重复序列的同源重组作用去除标记基因。这些重复序列可以是转基因卡盒的任何部分，如启动子、终止信号等。比如，噬菌体可以在其编码的整合酶（int）及细菌整合宿主因子（IHF）帮助下，利用附着位点（attP）整合于大肠杆菌基因组的细菌附着位点（attB）。Zubko等（2000）报道在两个attP位点应用染色体内同源重组消除选择标记基因，且不带有INF及IHF蛋白的转化体系。他们的研究结果表明，通过染色体内重组及两步再生，可获得无选择标记的转基因植株。其机理与位点特异性重组相同，但也有其自身的特点：它不需要辅助蛋白参与，因而不会对植物基因组造成可能的伤害，也省去了遗传分离的环节。同源重组在植物核基因组中频率低，但是可以应用到叶绿体基因组中标记基因的剔除，因为叶绿体同源重组频率与重组酶介导的重组频率相当。