动物模型研究

耳鸣研究也需要动物模型，但以往的耳鸣研究多局限于人类，这大大限制了对耳鸣机制的深入了解。动物不可能用语言表达其主观感觉，人与动物无法用语言来交流，所以只有通过观察动物的某种行为反应或生理反应，才能确定动物是否感觉到了耳鸣。目前的方法多以巴甫洛夫条件反射原理，建立耳鸣的动物模型。耳鸣动物模型有广泛用途。可以筛选治疗药物和治疗方法，还可以进行电生理研究，如自发神经活动（直接、间接记录）、自发脑电、诱发脑电（mapping）等。用脑片和组织化学等方法进行耳蜗、耳蜗核、外侧膝状体、下丘、听皮质的形态学研究，用cfos基因表达及11C－标记的去氧葡萄糖（2－deoxyglucose，2－DG）等免疫组化方法进行脑功能研究。

（一）耳鸣动物模型研究简况

1．推测阶段　首先假设正常动物没有耳鸣，这一点应该是共识且被公认的。在人类许多正常人也有耳鸣，人可以自由用语言表达耳鸣的感受，动物则不能。如果认为正常动物也可能有耳鸣，那将无法研究动物的耳鸣。多年来的临床现象提示，水杨酸可以导致耳鸣及听力下降，而且这种现象是可逆的，停药后耳鸣消失，听力也恢复。所以，许多学者用水杨酸作为动物造模的药物。但是，怎样知道注射水杨酸后动物产生了耳鸣呢？最初，人们按照临床经验，推测动物产生了耳鸣，但并没有发现动物有异常的行为表现。

2．电生理评价阶段　1980年，Sasaki首次用放射自显影方法研究耳蜗破坏后动物脑代谢情况。

（1）注入动物体内的放射性示踪剂为14 C－2－DG，损伤豚鼠单侧耳蜗术后2、7、21d处死动物，观察脑片情况，发现手术同侧耳蜗核、对侧下丘、对侧内漆体神经核代谢活动显著下降，21d后上述核团的代谢活动明显增加。如果仅仅损伤中耳，可引起相同的听觉传入下降但无随后的代谢活动的恢复。对上述结果的有力解释是，代谢活动增加反映了与耳鸣相关的神经活动的出现。这种神经活动被动物感知为耳鸣。损伤中耳后没有随后的代谢活动的恢复，表明代谢活动的恢复与听力下降无关。只有损伤耳蜗或听神经才可能导致随后代谢活动的恢复。因此，判断动物产生了耳鸣。这一研究提供了耳鸣出现的最早生理学表现，开辟了耳鸣研究工作的新视角。然而，这仅是一种有说服力的解释，但仍存在许多问题。首先，代谢活动增加并不必然与神经活动增加有关，胶质细胞代谢或神经元间抑制也可能产生2－DG摄取增加，并可能伴发兴奋性通路放电的不变甚至下降。其次，活动恢复可能反映不规则自发活动的总的增加，并非必然地被感受为声音。在人类外科方法诱发耳鸣的效率为50%。因此，可能仅仅部分动物会发生耳鸣，又不知道哪些动物会产生耳鸣时，不可能在耳鸣和代谢活动之间建立准确的相关性。为解决这些关键问题，学者们改变了诱发动物产生耳鸣的方法，并且开展了下丘自发活动的电生理评价。

（2）给豚鼠腹腔注射水杨酸钠450mg/kg之前和之后2h记录自发活动，用柱形图方法评价自发活动并代表细胞放电的主频。结果显示：给予水杨酸后细胞自发放电活动显著增加。注射生理盐水的对照组不受影响。从小脑蚓部记录的自发活动也不受水杨酸影响。因此，下丘自发活动的增加并不是水杨酸对神经系统非特异作用引起的。

（3）用强噪声（104dB）研究下丘诱发电位与刺激音时相的关系，发现强噪声与下丘微量注射γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）拮抗药荷包牡丹碱的效应相似，提示强噪声可降低GABA对下丘神经元的影响。噪声导致下丘可塑性的改变，从而引发耳鸣和听觉过敏。

以上资料均显示，动物在某种情况下神经活动的改变与耳鸣的出现高度相关，然而，没有证据表明这些动物的耳鸣是由水杨酸引起的，其结果不能解释与耳鸣的相关性。因此，需要建立有行为反应的模型。如果出现耳鸣，动物则出现某种行为反应；如果没有出现耳鸣则不出现该种行为反应。即使不能用语言沟通，通过这种行为反应也就很容易和直观地知道动物是否有耳鸣了。

3．行为学模型阶段　建立动物耳鸣的行为反应模型是一个巨大挑战。从行为角度来看，主要问题是不能在准确时间内开/关耳鸣信号。标准的巴甫洛夫条件反射包括条件刺激（condition stimulius）和非条件刺激（uncondition stimulius）。传统的条件反射是动物听到口哨声就来到主人身边饮食。在这里，条件刺激为声音，非条件刺激是食物或水，而且是奖励性的。经过强化训练后，动物很快形成了条件反射：听到口哨声就来饮食。很遗憾，我们不能精确地开关耳鸣。所以，只好采用一种相反的方式来形成条件反射。将非常渴或非常饿的动物24h暴露于持续的背景声音中，训练时才给予水或食物，动物因为渴或饿迅速不间断地饮食。当这种背景声音短暂停止时紧接着给予电击，动物就不敢来饮食了。经过强化训练后，动物形成了条件反射：背景声音停止，动物害怕电击而不敢来饮食。即使不再给予电击，动物听到背景声音停止也就不敢再来饮食了。此时给动物腹腔注射水杨酸，如果动物出现了耳鸣，则分辨不清背景声音是否停止，就会来饮食，便会很快忘记这种害怕的条件反射；反之，如果动物未出现耳鸣，则仍然保持这种害怕的条件反射。按照这样的试验设计，Jastreboff最早建成了动物模型。证实动物确实感受到了耳鸣。为取得渴或饿的稳定程度，应将动物置于部分剥夺水的环境下，使动物体重下降至原来的80%。训练箱顶部放置水瓶或食物瓶，动物学会从管子中吸水，或从瓶中取食，每吸或每食一次都被计数（通过吸水或饮食计数器）。

（二）水杨酸耳鸣动物模型

1．动物的选择　目前只有用豚鼠、大鼠建立耳鸣动物模型的报道，其他动物尚未见文献报道。实际上，狗、猫、小鼠等也能够用作实验动物。特别容易惊恐的动物不适合行为学试验。

2．训练系统的硬件　美国Lafayette公司有全套产品，包括吸水计数器、训练箱、电刺激器、定时器、给声系统等，可同时训练多个动物。我们自己设计的系统包括吸水计数器和训练箱（Lafayette公司产品），吸水计数器型号Model－102。训练箱系有机玻璃制成，内径43cm×23cm×23cm，箱底是不锈钢栅，箱顶置吸水管。箱底接电刺激器的负极，箱顶吸水管接电刺激器的正极。吸水时动物的身体接通该电路，可以给予电击。该电路也与吸水计数器连接，可以准确记录动物的吸水次数。电刺激器为日本光电Model8201型，隔离器型号SS102J。用SDK－2型数字式定时控制器将听力计和电刺激器同步。给声系统包括Madsen OB822临床听力计，Madsen PA501功放和飞乐牌YD5－2004电动扬声器（8Ω）。扬声器位于动物正上方以使所有动物感受到的声音强度相等，均为55dB SPL白噪声。

3．训练系统的软件　用Vasual Basic 5．0编写的可执行程序（V　1．0），称为“大鼠饮水记录训练系统”。该系统界面良好，人机对话方便，可操作性强。

4．具体训练方法　条件反射训练在另一间隔声室里进行，每只动物每天训练1次，每次30min。条件刺激是背景声音（55dB SPL白噪声）的随机停止，共呈现5次，分别在第3、9、17、24、29分钟左右出现，每次30s。非条件刺激是电击，1．5mA，持续0．5s，在条件刺激出现时的第9秒、第18秒或第27秒给予一次即可。训练时给动物供水，按7～10滴/min将供水量控制在15～20ml以内。用自动计数器记录吸水次数。条件刺激出现时的吸水次数为B，条件刺激不出现时每30秒的平均吸水次数为A，吸水率R＝B/（A＋B）。训练分三阶段：①适应训练期。目的是让动物适应条件刺激并持续吸水，吸水率应该等于或接近0．5，动物吸水次数一般为6　000～8　000次，如果少于350次则被淘汰。②条件反射训练期。条件刺激出现时给予电击，动物因恐惧电击而减少或停止吸水，吸水率应等于或接近0；经2～3d强化训练后，动物建立了“背景噪声停止－吸水率下降或停止”的条件反射。③条件反射消除期。条件刺激出现时不再给予电击，观察条件反射的消除或遗忘时间，吸水率逐渐恢复到0．5。

5．注意事项及要点

（1）增加吸水次数，尽可能控制供水量（7～10滴/min），既能让动物在30min的训练时间里补充足够水分（生理需要量15～20ml/d），又能使动物持续不断地吸水（每30min　6　000～8　000次，甚至到10　000次以上）。增加吸水次数有利于观察动物吸水行为的变化，也利于给予电击。

（2）适当调整训练程序：文献报道的方法是每天训练1次，每次45min，条件刺激（背景噪声停止）随机出现4次，在背景噪声停止的最后1s给予电击一次。而我们是每次30min，条件刺激出现5次，在背景噪声停止的第9秒、第18秒和第27秒给予电击1～3次。这样做的目的是增加训练次数，最根本的是避免了电击失败。如果第1次电击成功则不再给予第2和第3次，如果第1次失败则给予第2次，一直到第3次。一般认为，非条件刺激与条件刺激在时间上跟得越紧，条件反射越容易形成。但我们的预试验提示，动物在背景噪声停止7s后才能有行为反应，也就是说，大鼠对背景噪声停止的听觉分辨发生在7s后。所以，我们选在第9秒时给予第1次电击。因为动物吸水时用舌头舔供水管，通电后电击打在舌头上，所以动物能很快形成条件反射。但电击次数不能太多，且电击强度不能太大。否则，容易使动物的学习能力降低。适宜的电流强度是1．5mA，持续时间是500ms。

（3）从理论上讲，背景噪声的频率应该接近大鼠的耳鸣频率（11kHz、12kHz或15kHz附近）。因此，背景噪声应该是以上述频率为中心的窄带噪声。但一般扬声器的频响效应均在8kHz以下，不能产生如此高频的窄带噪声。所以，我们采用高频扬声器以产生白噪声，而且，经频谱分析，我们的给声系统发出的背景噪声频谱从400Hz到12．5kHz范围内是平坦的。另外，我们的隔音室的本底噪声在500Hz以上均＜25dB SPL，这充分保证了背景噪声的停止能够成为明显的条件刺激信号而被动物分辨出来。

（三）用动物惊吓反射为指标观察耳鸣

Turner和Salvi等发展了惊吓反射为指标观察耳鸣。惊吓反射是指大鼠在60dB噪声环境中，突然听到外界强声（115dB SPL）刺激时，会因惊吓而产生全身抖动，如果在给予此声音前30～500毫秒插入一个无声间隔后，此反射将会被抑制。注射水杨酸钠等致耳鸣药物后，由于大鼠产生耳鸣，致使其无法分辨无声间隔，则惊吓反射抑制现象消失。利用惊吓反射建立耳鸣动物模型，可以缩短实验周期至2周甚至更短。只要大鼠有正常听力，本模型即可制作成功。

当16kHz的背景噪声中出现于无声间隔时水杨酸钠引起的耳鸣填补了此无声间隔，动物的耳鸣如果是16kHz，那么大鼠将无法分辨出此无声间隔，认为背景噪声是连续的，则随后的噪声刺激将会引起一个大的惊吓反射，听觉惊吓反射抑制现象消失。当背景连续噪声为6kHz和12kHz时，大鼠在无声间隔时也听到了耳鸣声音，但由于耳鸣声音和背景噪声不同，动物仍可以分辨出二者的不同。这样就使听觉惊吓反射抑制现象仍然存在，故在6kHz和12kHz的背景噪声训练时，听觉惊吓反射抑制现象无明显变化。实验结果证实了大鼠在注射水杨酸钠后产生了耳鸣，并且耳鸣的频率最可能为16kHz。本研究结果表明，剂量为250mg/kg的水杨酸钠可引起动物耳鸣。

本模型的主要优点就是动物自身可以作对照，对比应用安慰剂（生理盐水）和不同剂量水杨酸钠后动物饮水次数的变化，可以检测出动物耳鸣的存在与否。该技术非常有效和可靠，且只需很少的设备和外部条件即可完成试验。

本研究中水杨酸钠引起耳鸣的行为学变化与水杨酸钠引起的听力损失无关。因为惊吓反射抑制现象存在。说明水杨酸钠（250mg/kg）引起的听力损失＜60dB，这就意味着大鼠仍然可以观察在强声刺激前100ms出现的那个60dB的弱刺激声而出现惊吓反射的抑制现象。

（四）用动物跳台逃避为指标观察耳鸣

Guitton等（2003）利用跳台法建立的耳鸣动物模型同样取得了令人满意的结果。本模型通过将“声刺激”和“电击－跳台反应”在时间上进行结合、加强并最终使动物建立“声刺激－跳台逃避行为”的条件反射。条件反射建立后，动物对声音（10kHz，60dB SPL）反应敏感，并且通过7～10d的条件强化，动物对此条件反射的记忆时间较长，平均在6～7d内对声音的正确反应率可维持在80%以上，因此较为适合实验周期相对较长的耳鸣实验。另外，与饮水抑制法相比，此模型还具有在实验过程中对动物的全身状态影响较小的优点，因此较适合应用于实验中对动物身体状态有特殊要求的情况，如实验中对耳鸣动物进行手术干预等。国内张恩柱等（2007）也建立了该模型，并进行了改进。

（五）动物模型的鉴定

行为学模型可以排除水杨酸钠的非特异性作用（听力下降、痛阈改变、干渴等）的影响。在条件反射建立前开始给水杨酸，如果动物仅有听力下降而无耳鸣，条件反射期的吸水抑制程度应该较轻；在消除期，动物应该很快消除对恐惧的反应。然而，事实却与此相反，注射水杨酸后动物的吸水抑制更重，需要5天才能消除对恐惧的反应。水杨酸对电刺激的镇痛作用不能合理解释实验结果。水杨酸对动物渴的程度无明显影响，既不增加也不减少动物的水消耗。水杨酸和噪声共同作用并不增加动物死亡率。用视觉模式（用持续的灯光代替背景噪声，灯光关闭作为条件刺激）验证结果表明，水杨酸诱发的行为反应严格限于听觉系统内。用奎宁进行的行为学实验表明，奎宁使动物产生与水杨酸相同的行为表现。所以，水杨酸造成的大鼠行为学模型是有效的、可信的。

水杨酸钠诱发的人类耳鸣声如同窄带噪声，主频在几千赫兹内。因为大鼠有较高的听力频率范围，所以水杨酸诱发大鼠的耳鸣频率可能移动到较高频率区。试验中发现，让11kHz纯音与电休克这两种刺激产生密切关联后，大鼠的反应强度9kHz比8kHz强烈，12kHz比13kHz强烈，对10kHz和11kHz反应最强，表明10kHz和11kHz是耳鸣的主频率。200g/kg水杨酸诱发的耳鸣相当于10kHz纯音。我们的试验表明，尼莫地平能够部分抵消水杨酸引起的作用。

在临床上，奎宁与水杨酸制剂引发的人类耳鸣相似。用奎宁代替水杨酸钠，造成的动物模型其表现非常相似，表明模型是成功的。

其他利用水杨酸造模的方法很多，包括惊跳法、跳台法、穿梭箱法、压杆取食法等，只要符合条件反射的原理，就能建立动物模型。

（六）行为学动物模型的局限性

行为学模型可用于耳鸣神经机制、客观检测、诊断及治疗等各方面的研究，也可用于评价药物的治疗效果，因此，具有重要研究价值。用该模型测得动物耳鸣频率为10kHz 或11kHz，200mg水杨酸诱发的耳鸣强度为72dB SPL。尼莫地平是钙离子拮抗药，临床上常用于治疗耳鸣。骨参舒耳片是解放军总医院近年来应用的临床验方，主要由骨碎补、丹参、葛根等多种中药成分组成，具有补肾益精、健脾升阳、化痰祛湿、宣通耳窍之功效，临床治疗耳鸣有效率达71．7%。尼莫地平和骨参舒耳片治疗耳鸣作用机制已经有较多的电生理和形态学研究的报道，本研究又为二种药物从整体水平提供了行为学证据。

虽然行为学模型具有重要研究价值和意义，但仍存在一定的局限性。首先，本模型仅仅是水杨酸诱发的耳鸣而不是其他药物诱发的耳鸣；其次，该模型不能鉴别耳鸣侧别；再次，该模型也不能确定耳鸣产生部位（以往认为水杨酸的作用主要是外周的，但越来越多的资料显示，水杨酸也有中枢作用）。因此，耳鸣动物模型仍有待深入研究。

另外，动物强噪声暴露后可听力下降，推测动物与人类一样可能产生了耳鸣。比起有行为反应的动物模型来，至今噪声诱发的耳鸣动物模型尚得不到学者的广泛认可。

（王洪田）

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