细胞原位杂交

（一）实验目的

原位杂交组化（in situ hybridization histochemistry，ISHH）简称原位杂交，属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交。再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织、细胞内待测的核酸复性结合而使得组织、细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。这里主要介绍培养细胞的原位杂交技术，用该方法检测整合素链接激酶（Integrin-Linked kinase，ILK）在肾小管上皮细胞的表达。

（二）实验试剂

1.2.5ml/L的醋酸——2.5ml/L醋酸酐

三乙醇胺　　　　　13.2ml

氯化钠　　　　　　5g

浓盐酸　　　　　　4ml

醋酸酐（用前加）2.5ml。

2.20×SSC（pH7.0）

氯化钠　　　　　175.3g

枸橼酸钠　　　　88.2g

双蒸水（ddH2O）定容至1L。

3.100×Denhardt’s液

聚蔗糖（Ficoll）　　　　　1g

聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）　　　　　1g

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）　　　　　1g

ddH2O定容至50ml。

4.杂交液（50ml）

100%去离子甲酰胺　　　　　25ml　　　　　50%

100%葡聚糖硫酸脂　　　　　5mg　　　　　10%

100×Denhard’s　　　　　　0.5ml　　　　1mmol/L

Mtris-HCl（pH8.0）　　　　0.5ml　　　　10mmol/L

5mNaCl　　　　　　　　　　3ml　　　　　0.3mmol/L

0.5mEDTA（pH8.0）　　　　0.1ml　　　　　1mmol/L

10mg/ml变性鱼精DNA　　　　0.5ml　　　　100μg/ml

ddH2O定容至25ml。

5.0.1m甘氨酸/PBS

甘氨酸　　　　　7.5g

Na2HPO4　　　　30.8g

NaH2PO4　　　　2.8g

NaCl　　　　　　8.5g

溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高压，室温储存。

6.TSM1（1000ml）

1mTris-HCl（pH8.0）　　　　　100ml

5mNaC　　　　　　　　　　　　20ml

1mmgCl2　　　　　　　　　　10ml

ddH2O定容至1000ml。

7.TSM2（1000ml）

1mTris-HCl（pH8.0）　　　　100ml

5mNaC　　　　　　　　　　　20ml

1mmgC　　　　　　　　　　　250ml

ddH2O定容至1000ml。

8.抗体稀释液（100ml）

BSA　　　　　　　　　　　　　1.0g

TrisX-100　　　　　　　　　　0.4ml

叠氮钠　　　　　　　　　　　　0.4g

0.05mol/LPBS（pH7.2）调至100ml。

9.0.05mol/LPBS（pH7.2）1000ml

Na2HPO4　　　　　15.4g

NaH2PO4　　　　　1.4g

NaC　　　　　　　4.25g

10.去内源性酶液（40ml）

10%甲醛　　　　　4.0ml

冰醋酸　　　　　　10.0ml

加0.05mol/LPBS至40ml。

11.0.4%Triton-X100。

（三）实验流程

1.4%多聚甲醛/PBS，室温下固定15min。

2.PBS洗涤细胞10min×3。

3.用0.2%Triton-x/PBS透化细胞室温5min。

4.PBS洗涤细胞10min×3。

5.2×SSC洗10min×2。

6.1×SSC洗5min×2。

7.预杂交，不含探针杂交液杂交1h，42℃。

8.加2×SSC液体入细胞中，将盖玻片揭下。

9.2×SSC洗20min×2。

10.加含探针杂交液（2ng/μl），杂交过夜。42℃。

11.加2×SSC液体，将盖玻片慢慢揭下，轻轻摇动。

12.2×SSC洗轻摇，30min×2，37℃。

13.1×SSC洗，15min×2室温。

14.0.5×SSC洗，15min室温。

15.TSM1平衡1～2min。

16.加入抗探针的碱性磷酸酶复合物37℃30min。

17.TSM1室温洗15min×2。

18.TSM2室温平衡1～2min。

19.NBT发色，观察，蓝色为阳性信号。

20.TSM1室温洗1min封片。

21.镜检。

（四）典型图例

见图1-17。

（五）注意事项

1.从组织中提取的探针必须特异。

2.为有效防止外源性RNA酶的污染，显微载玻片，盖玻片和培养皿分别参考有关要求作浸泡、清洗，干燥和用铝箔纸包裹后烘烤灭RNA酶处理。

图1-17　细胞原位杂交检测ILK在肾小管上皮细胞的表达（×200）

3.采用冻存管包装的试剂，请在开盖前稍加离心，以免试剂损失。

4.增效液含有低毒性试剂，请小心操作！

5.按顺序混合配制，避光，配制后应现用。

6.严禁让切片在杂交和染色过程中出现干涸现象。

7.杂交液用量务必与盖玻片规格匹配，否则将容易出现非特异背景。

8.如果间质细胞出现非特异着色，很可能是杂交后操作过程中出现干片或杂交后冲洗不充分所引起。

参考文献

[1]洪权，冯哲，陈香美，等.肾小管上皮细胞转分化中整合素连激酶表达及其与衰老的相关研究.中华老年医学杂志，2006,25:293-297.