（一）标本的荧光标记
1.直接免疫荧光标记染色法
（1）取100μl抗凝血标本或5×105个细胞，与20μl单克隆荧光标记胞膜抗体在流式细胞仪上样管中，置室温下避光孵育15～20min。
（2）加入稀释后的溶血素2ml，混匀后置室温、避光10～15min（注：溶血素的用量及溶血时间可根据标本中红细胞的含量及试剂盒说明书而定），1 500r/min离心5min。
（3）弃上清，加入PBS（含0.5%BSA，0.1%NaN3）洗涤，1 500r/min离心5min。
（4）弃上清，加入0.5ml PBS，上机检测。
2.同时标记胞膜、胞质抗体的方法
（1）取100μl抗凝血标本或5×105个细胞，与20μl单克隆荧光标记胞膜抗体在流式细胞仪上样管中，置室温下避光孵育15～20min。
（2）加入稀释后的溶血素2ml，混匀后置室温、避光10～15min（注：溶血素的用量及溶血时间可根据标本中红细胞的含量及试剂盒说明书而定），1 500r/min离心5min。
（3）弃上清，加入500ul破膜剂，混匀，室温，避光孵育10min。
（4）加入PBS（含0.5%BSA，0.1%NaN3）洗涤，1 500r/min离心5min。
（5）弃上清，加入20μl单克隆荧光标记胞质抗体，置室温下、避光共同孵育30min。
（6）加入PBS（含0.5%BSA，0.1%NaN3）洗涤，1 500r/min离心5min。
（7）弃上清，加入0.5ml PBS，上机检测。
（二）结果分析
1.门技术的应用 门技术是FCM常用的一种技术，它是在FCM检测中为避免其他非目的细胞对检测结果的干扰，采用门技术将其他细胞排除于分析之外，只分析一群特定的细胞表面标记。根据细胞的体积、颗粒的特点，选用前向散射角和侧向散射角信号将目标细胞与其他细胞分开；根据细胞表达抗原水平高低所产生荧光信号水平的高低，对特定细胞进行分析，均采用门技术进行分析。
2.CD45/SSC设门技术在白血病免疫分型中的应用 CD45是一种白细胞抗原，它在整个白细胞中均有表达，但是在红细胞、血小板无表达。同时，CD45在成熟细胞的表达要强于幼稚细胞，而且CD45在淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的表达强度也不相同。CD45表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、幼稚细胞依次减弱，红细胞不表达CD45。SSC反应细胞的颗粒性，成熟粒细胞最高，依次是单核细胞、淋巴细胞、幼稚细胞、红细胞（图5-1）。这样以CD45为纵坐标，SSC为横坐标作图就可以将外周血或骨髓穿刺液中的细胞分开，从而达到将白血病细胞与正常细胞分开分析的目的。通过CD45/SSC设门结合以多色荧光抗体分析的方法，可以去除正常细胞的干扰，大大提高免疫分型的准确性。
图5-1 CD45/SSC设门后有核细胞分辨情况
注：R2.淋巴细胞；R3.单核细胞；R4.幼稚细胞；R5.粒细胞；R6.有核红细胞
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