学】飞秒，看清生命过程

责任编辑：龚聪

化学 CHEMISTRY

科学家用超快速X射线激光脉冲照射蛋白质分子，在几飞秒内记录下它的动态变化并合成电影，来揭开药物如何发挥作用、光合系统如何转换能量的秘密。

撰文 彼得拉·弗鲁姆（Petra Fromme）约翰·斯彭斯（John Spence）翻译 马金鸣

彼得拉·弗鲁姆是亚利桑那州立大学应用结构发明中心主任。

约翰·斯彭斯是亚利桑那州立大学生物X射线自由电子激光（XEFL）科技中心的科学主任。

精彩速览

蛋白质无时无刻不在运动，参与着生命必需的化学反应。这些运动非常细微，又非常迅速，难以被显微镜看到。借助仅持续千万亿分之一秒的X射线激光脉冲，研究人员制作出“分子电影”，揭示蛋白质在反应过程中发生的结构变化。

这些电影以前所未有的细节呈现生化反应，解释为什么药物有时无法与靶标蛋白结合，以及植物的光合作用如何转换能量。

在加利福尼亚州帕罗奥多市（Palo Alto）附近的一座山脚下，科学家在位于地下的实验室里忙碌地穿梭着，为一系列“爆炸”实验做最后准备。他们的计划是：炸飞微小的蛋白质晶体，揭开大自然最神奇的秘密，即植物的光合作用如何把光转化为化学能。如果他们成功了，人类很可能就将迈进无限清洁能源时代！

2009年12月，一群缺少睡眠的研究人员和学生已经在斯坦福国家加速器实验室（SLAC）连续工作了数天，为一项实验做最后的准备。SLAC拥有世界上最强大的X射线激光器：直线加速器相干光源（LCLS），能够将电子加速至接近光速。其中一组人员正在紧张地调试着蛋白质晶体喷头，将它对准激光。另一组则把蛋白质晶体装入喷射器，这里用到的是光系统I蛋白，这种蛋白在光合作用中扮演着重要角色。

在两英里加速器隧道尽头，蛋白质晶体将“拥抱”炽热的激光。在晶体爆炸之前，科学家会用一种新技术给它照张相。这项新技术能够在几飞秒内，也就是千万亿分之一秒，采集一系列图像，并合成动画。借助这项技术，科学家有望在最细微的尺度上重塑人们对生物学的理解。

美国物理学家理查德·费曼（Richard Feynman）说过：“一切生命行为都可以用原子运动来解释。”但在此之前，我们还不能以这样的速度直接观看生命体中原子和分子的运动。如今，通过串行飞秒晶体学（SFX），我们可以观看高速的分子运动，研究药物如何影响病变细胞，以及化学反应如何将能量转换为不同的形式。

世界各地的研究团队逐渐开始应用SFX成像技术，揭示试验性药物调节血压的细节过程，为研发更有效的高血压药物铺平道路。这项技术还帮助研究人员掌握了昏睡病中摧毁血液红细胞的酶结构（昏睡病是寄生虫引发的严重疾病）。借助SFX成像技术，光合作用（将水分解成氢气和氧气）的初始反应步骤在研究人员面前首次变得清晰起来。

回到2009年的那个地下实验室。当X射线激光脉冲摧毁精心制作的蛋白质晶体时，我们承担着巨大的风险。很多科学家并不看好SFX成像技术，拒绝为我们提供资金。但是，当漂亮的X射线衍射图案出现在计算机屏幕上时，大家的欢呼声在房间内回荡，我们见证了X射线科学新分支的诞生。

植物光合作用

给分子拍电影

地球上的生命离不开光合作用，因为这个生化过程把阳光转化成了化学能。一种新型分子电影让科学家首次看到这一过程的动态变化。研究人员用可见光模拟阳光照射叶片，刺激蛋白质开始光合作用，随后用强大的X射线激光在极短的时间内拍照记录下蛋白质的变化。把5个步骤（如下图显示）的快照按时间顺序组合在一起就做出了蛋白质分子电影。

1 光响应蛋白（光系统的一部分）形成排列有序的微小晶体，便于结构检测。每秒钟有上万个纳米晶体通过喷墨机。

2 用绿光脉冲模拟阳光照射叶片，刺激纳米晶体里的蛋白质分子发生变化。这是光合作用的第一步，在几飞秒内就完成了。

3 随后用强大的X射线激光脉冲照射晶体，产生独特的X射线散射图案，相当于在照射的那一瞬间给晶体拍了一张快照。暂停之后，重复绿光和X射线激光脉冲进行下一帧拍摄。

4 射线激光脉冲只持续50飞秒，但它携带的巨大能量足以摧毁蛋白质。

5 软件把上万张二维快照组合起来就做出了蛋白质结构的3-D图像。把整个反应过程中的蛋白质结构图像拼接起来就做出了蛋白质电影。

X射线图像

在SFX成像技术出现之前，科学家在检测某些化学结构变化方面取得了惊人的进步，但他们还不能观察最精细、最复杂的生物结构的实时变化。例如，在20世纪80年代，已故的化学家艾哈迈德·H·泽韦尔（Ahmed H. Zewail）发明了一种在化学反应中使用超快速可见光激光脉冲观察原子的方法。然而，可见光的波长太长，无法区分蛋白质分子的细微结构。近年来，显微技术的巨大进步让我们能看到蛋白质和病毒的原子级图像，但速度仍跟不上像光合作用那样快速的化学反应。

我们决定使用X射线，因为它具有足够的速度和分辨率来记录生物化学的动态反应。这项工作的关键在于开发出一项技术，能够在X射线破坏样品前的一瞬间生成样品的图像。传统做法是，科学家先制备出蛋白质大晶体；随后，用X射线照射晶体，并记录X射线的散射或衍射图案。因为晶体中的分子按照某种方式有序地排列，它的X射线散射图案也遵循着一定规律，这样科学家就能根据散射图案确定晶体分子中原子的类型和位置。这种方法称为X射线晶体学，我们开发的串行飞秒晶体学使用了相同的原理来观察原子结构，但速度要快很多。

但是，X射线最终会破坏我们要观察的分子。科学家普遍认为，使用高能聚焦X射线激光器会让结果更差。X射线激光器发出的强光足以穿透钢铁，留下一个孔洞。面对这样的强光，一个脆弱的生物分子根本不会有任何胜算。所以，我们需要赶在X射线激光破坏样品前，在几飞秒的时间内捕捉到图像。为了让大家对飞秒这个概念有所理解，我们可以这样类比，1飞秒和1秒之间的区别就跟1秒和3200万年的区别一样。

SFX成像技术的关键就在于，从分子被X射线激光脉冲击中，到分子上的电子被高能X射线剥离前，存在几乎难以察觉的极短间隔。一旦失去电子，分子上带正电的残余部分相互排斥，导致分子扩张并最终爆炸。

SFX成像技术的工作原理是，首先，我们让蛋白质分子相互作用并形成微小晶体；然后，向晶体发射高能X射线激光脉冲，激光脉冲非常短，足够在激光“肢解”分子之前，允许X射线从分子表面散射出去；紧接着，检测器捕获散射的X射线，通过分析散射图案得到蛋白质分子中原子的类型和位置。把蛋白质晶体束从不同角度射入X射线，我们就能重建它的3-D结构。最后，收集同一个反应在不同时间点的图像，并按照时间顺序组合起来，我们就能把反应过程用电影记录下来。

激光斑点：在串行飞秒晶体学成像中，检测板上的灰点显示了X射线激光与蛋白质晶体碰撞后的散射图案，可用来研究蛋白质结构。

晶体图像

制作分子电影的第一步开始于2000年，当时都在瑞典乌普萨拉大学的分子生物物理学家亚诺什·豪伊多（JanosHajdu）和理查德·诺伊策（RichardNeutze）通过计算发现，被X射线击中的分子会在10飞秒后爆炸。所以，科学家必须在10飞秒内完成拍照。现工作于德国电子同步加速器（DESY）的亨利·查普曼（Henry Chapman）和他的同事在2006年刚好能够做到这一点，他们采用“先衍射后破坏”（diffract then destroy）的方法获得了一张包含两个小棒的低分辨率图像，之后携带巨大能量的X射线就把氮化硅膜样品刻穿了。

但这种方法在脆弱的生物细胞上行得通吗？当我们提议试试的时候，科学圈的很多人并不看好。我们最初申请的10个项目全都被拒绝了。有些怀疑者说X射线激光脉冲不够短，有些说蛋白质晶体太小，给不出可检测的信号，还有些说我们没法在X射线激光脉冲照射晶体时观察它的取向，也就没法确定它的结构。

但是我们认为，如果其他分子能用这种方法成像，就像查普曼证明的那样，生物分子为什么不能？彼得拉·弗鲁姆（Petra Fromme，本文作者之一）和她的团队决定用你能想象到的最难的实验来证明SFX成像技术：光系统I。这个系统包含36个蛋白和300多个捕捉光子的绿色素和橙色素，是迄今为止用X射线分析过的最复杂的蛋白结构。弗鲁姆对光系统I有着深刻的理解，她花了好几年时间制备光系统I蛋白的晶体，并尝试用其他方法确定它的结构。另一个理由是，我们觉得光系统I的大小或许是个优点，因为即使最终只有一小部分衍射图案，我们也能得到一张低分辨率图像，足够辨认出它就是光系统I。这正是2009年我们在那个地下实验室所做的工作。

小晶体也能成像

要获得蛋白质分子快照，我们首先要有光系统I的晶体。在传统晶体学中，科学家制备大晶体用于X射线成像，是因为大晶体能散射更多的X射线，成像效果更好。但对一些蛋白质来说，往往需要数年的实验才能得到排列有序的大晶体。对个别蛋白质来说，似乎根本没法得到它的大晶体。光系统I就是其中之一。

相反，SFX成像技术使用的是在实验室更容易制备的纳米级小晶体。但使用纳米晶体也带来了新的挑战：不仅要用它获得足够强的信号，还要克服一些基础的物理难题，比如说如何检测这些在显微镜下都看不到的晶体？以及如何把它们送向X射线脉冲的正前方，还要精确地在1秒内完成120次？

首先，我们需要找到一些新方法来看到这些纳米晶体。其中一种方法叫做手性晶体的二阶非线性成像（SONICC）：晶体将两束超快速红外脉冲转换为一个绿色光子，纳米晶体被光子点亮，就像夜空中的萤火虫，这样我们就能检测到它们。

另一个方法让我们能够以恒定的速率把蛋白质晶体射入X射线激光脉冲。约翰·斯彭斯（John Spence，本文作者之一）与亚利桑那州立大学的物理学家乌韦·魏尔斯塔尔（Uwe Weierstall）、布鲁斯·多克（Bruce Doak）共同做出了一个功能类似于喷墨打印机的设备，把含有纳米晶体的溶液流喷向X射线束。这个喷墨机非常精确，每次只允许一个纳米晶体进入激光束。

为了防止设备堵塞导致纳米晶体流中断，魏尔斯塔尔设计了一个能产生细流的宽喷嘴。要达到这个效果，他用氦气流包裹住喷嘴的末端，这样尽管喷嘴本身很宽，但聚焦后晶体流只有人类头发直径的几分之一。

所有设备到位之后，我们还面临着一个问题：如何处理海量数据？单次实验就会产生高达100TB数据，足够塞满25台顶级台式电脑的硬盘。为了构建蛋白质的3-D图像，我们必须找出数以万计快照中的晶体取向，并把它们组合起来。因此，我们跟当时都是DESY查普曼团队成员的理查德·基里安（Richard Kirian）和托马斯·怀特（Thomas White）合作开发了一款特殊软件。借助这款软件，我们能够把海量的数据转换成精确的3-D分子图像。

一步一步地，我们的技术不断提高。到了2014年，我们第一次观察到了光合作用中两个重要参与者，捕捉光的光系统I和铁氧蛋白之间的电子传递过程。

当光照射到光系统I时，光被转化成电子。接着，电子被铁氧蛋白转移，用于将CO2转化为生物分子。当铁氧蛋白离开时，光系统I蛋白马上就溶解了，让跟踪这个反应变得异常困难。只有超高速的SFX成像技术才能捕捉如此迅速的变化。

这项研究的下一个挑战，也是弗鲁姆作为一名生物化学家重点关注的课题——弄清楚植物如何只用阳光和地球上最丰富的金属（铁）就能把水分解成氢气和氧气。如果人类能像植物那样分解水，汽车和发电机就可以采用廉价、燃烧无污染的氢气作为能源，这正是可再生能源经济的终极梦想。

我们已经得到了第一批水分解过程的低分辨率快照。初步线索显示，反应涉及的光系统II蛋白发生了重要的结构变化。就在最近，日本冈山大学的沈建仁（Jian-Ren Shen）教授应用SFX成像技术获得了水分解过程更加精细的快照。下一步，我们希望做出原子级高清影像，展现水分解过程各个阶段的具体细节，揭开光合作用的秘密。

药物设计

现在，科学家开始用SFX成像技术制作各自的蛋白质电影，这不仅会带动未来的研究突破，更有当下意义的是，能够帮助设计更有效的新型药物。举例来说，在美国，高血压是中风和心脏衰竭的主要原因。以前，医生通常用血管紧张素II受体抑制剂（ARBs）来治疗高血压，因为ARBs能与细胞上的血管紧张素II受体结合，干扰血管紧张素收缩血管的功能。尽管第一代ARBs药物被证明是有效的，但由于它与血管紧张素II受体的结合能力很差，需要大剂量使用，这会引发更严重的副反应，包括头痛、头晕，以及偶尔出现的脸、喉咙肿胀等。

我们的研究揭示了ARBs与受体结合能力偏弱的原因：药物分子没有像预期的那样与受体完美结合，很多分子会从受体上滑落。如果有更精确的受体结构图像，新的ARBs药物就能更有效地控制血压。事实上，一种名为ZD7155的药物正在接受评估。

这些改进也有望改善其他药物。血管紧张素II受体属于G蛋白偶联受体家族，这个受体家族包括很多种类的受体蛋白，这些细胞表面分子帮助细胞感知周围环境并作出反应。罗伯特·莱夫科维茨（Robert J. Lefkowitz）和布莱恩·克比尔卡（Brian K. Kobilka）因首次发现G蛋白偶联受体家族的结构和功能而获得了2012年诺贝尔化学奖。G蛋白偶联受体在细胞存活和生长中扮演着重要角色，因此成为新药开发的重要靶标。观察这类受体的结构变化有助于药物化学家设计能精确结合受体的药物，减少副作用发生的几率。

南加利福尼亚大学的瓦季姆·切列佐夫（Vadim Cherezov）开展了血管紧张素II的实验，他说：“我们发现，之前所有关于受体和药物如何结合的猜测在很多重要细节上都是错误的。”举个例子，科学家通过SFX成像技术发现，在常温和传统晶体学常用的低温环境下，G蛋白偶联受体的结构是不同的，这意味着，根据冷冻温度下受体结构设计的药物，到了温暖的人体内，就难以与受体很好地结合（在一些情形下，药物的作用范围太大。治疗昏睡病的药物就有这个缺点。我们拍摄的蛋白电影表明：药物与引起昏睡病的寄生虫蛋白发生作用的同时，也会以相同的方式与人体细胞上的蛋白发生作用。更精细的图像可以帮助药物化学家设计只与寄生虫蛋白作用的药物）。

我们也对更多的研究人员使用SFX成像技术解决问题感到激动。比如，威斯康星大学密尔瓦基分校的马里乌斯·施密特（Marius Schmidt）和同事最近用分子电影来解释眼睛是如何看到事物的。虽然我们通常认为细菌没有视力，但它们身上有一些蛋白可以对光作出反应，这些蛋白正是我们视觉系统在进化上的祖先。借助前所未有的超高速SFX成像技术，施密特团队将拍摄的快照做成能以超慢速度播放的视频，弄清楚了细菌蛋白如何感知光线并作出反应。

施密特团队的成果展示了蛋白晶体如何在几飞秒内对光作出反应。具体地说，他们展示了蛋白质上的染色分子在光的照射下变成了黄色。这是有史以来人们第一次捕捉到因吸收光变成黄色的分子结构，这一变化是所有生物（包括细菌和植物）的光感知系统的基础，也是人类视觉的开始。

观察细菌蛋白对光的反应，不仅可以帮助我们理解视觉是如何产生的，它还让速度极快的化学反应以前所未有的细节全部呈现在人们眼前。施密特说：“这项技术大大缩短了人们与生命化学的距离。”

我们有理由相信，SFX成像技术必将推动蛋白质晶体学的发展，同时也会进一步加深我们对自然的理解。或许，在十年之内超过一半的已知蛋白质结构将不再是教科书上的静态图片，而是会动的3-D电影。

扩展阅读

Femtosecond X-ray Protein Nanocrystallography. Henry N. Chapman et al.in Nature, Vol. 470, pages 73–77; February 3, 2011.

X-ray Lasers for Structural and Dynamic Biology. J.C.H. Spence, U. Weierstalland H. N. Chapman in Reports on Progress in Physics, Vol. 75, No. 10, ArticleNo. 102601; October 2012.

X-ray Science: The Big Guns. M. Mitchell Waldrop in Nature, Vol. 505, pages604–606; January 30, 2014.

XFELs Open a New Era in Structural Chemical Biology. Petra Fromme inNature Chemical Biology, Vol. 11, No. 12, pages 895–899; December 2015.

The Birth of Molecules. Ahmed H. Zewail; December 1990.

Filming the Invisible in 4-D. Ahmed H. Zewail; August 2010.