小泡释放中的膜融合

迄今的研究工作已形成了一般性的框架，我们可用以解释神经递质的释放（图3-1）。

图3-1　突触前小泡释放分子机器的组构（彩图见图版此处）

（a）突触部位有突触小泡（SV，红色）、含有钙通道（蓝色）的活动带、突触后成簇的受体（橘黄色）。活动带的一个小泡正处在融合过程中，红色的神经递质正从融合孔释放。（b）介导钙触发的小泡融合分子机器图解。图右上方显示锚定突触小泡的一段，突触前活动带在中间。从右到左显示神经递质释放分子机器的3个功能性组成成分。右边为融合机器的轴心部分，它由SNARE、SM蛋白质复合体组成，这个机器包括SNARE蛋白、小突触小泡蛋白（VAMP）、突触融合蛋白-1（syntaxin-1）、SNAP-25(2)，还有SM蛋白Munc18。作为钙感知器的突触结合蛋白显示在中间，它由两部分组成。一部分是短的小泡内顺序，具有单个跨膜区；另一部分是两个胞质C2钙结合域，以复合蛋白（complexin）为助手起作用，复合蛋白结合在SNARE复合体上。活动带蛋白质复合体显示于左侧，包括RIM、Munc13和RIM-BP，还有在突触前质膜上的钙通道。在这个蛋白质复合体中，RIM结合到特定靶蛋白质，调控、协调活动带的所有3个功能：介导突触小泡入坞的RIM结合于小泡Rab蛋白；RIM结合于中央预处理因子——Munc13，激活小泡的预处理；为了快速的兴奋-分泌耦合，RIM结合到钙通道，有直接方式和通过RIM-BP的间接方式，募集钙通道达到锚定小泡的100 nm空间范围之内。神经递质释放分子机器的总体设计是，作为对动作电位的反应，在纳米级别的装置上能快速而有效地触发分泌过程，把融合分子机器、钙触发还有活动带蛋白质三者复合起来，这样把所有成分定位在一个合适的靠近范围之内。（图引自［11］）

一般说来，细胞内的膜融合是由SNARE及SM蛋白介导的。SNARE是soluble NSF attachment receptor protein（可溶性NSF附着受体蛋白）的缩写，SM蛋白是Sec1/Munc18-like protein（Sec1/Munc18样蛋白）的缩写。在融合反应中，这两个蛋白质实现循环性、周期性的结合和解离过程（图3-2）。在突触部位，小泡SNARE蛋白的小突触小泡蛋白（也称VAMP）和质膜上SNARE蛋白的SNAP-25及突触融合蛋白-1形成复合体。在SNARE复合体形成之前，突触融合蛋白-1以封闭构象存在，不能参与SNARE复合体的形成，必须等到突触融合蛋白开放以后才能让SNARE复合体组成。SM蛋白Munc 18-1原来结合于封闭形态构象的突触融合蛋白。作为融合的准备，封闭构象的突触融合蛋白开放，这样一来SNARE复合体就形成了。此时Munc 18-1仍然结合在组成SNARE复合体的突触融合蛋白上，但Munc 18-1把它的结合模式转变为与SNARE复合体相互作用的模式。SNARE/SM复合体的组装介导融合，而其去装配则实现了SNARE和SM的蛋白质再循环，以供进一步的应用（图3-2）。通过它们的装配/去装配周期而不断进行的Munc 18-1和SNARE复合体的缔合，对于融合是必需的。SNARE/SM蛋白质复合体的装配由一些蛋白质伴侣来维持，如CSP、突触核蛋白（synuclein），蛋白质伴侣功能的丧失将导致神经变性；SM蛋白复合体的去装配由一个进化上保守的特异ATP酶（NSF）及其接头蛋白SNAP介导［11］。

图3-2　SNARE/SM蛋白的活动周期及突触结合蛋白和复合蛋白在Ca2+触发融合中的作用

SNARE和SM蛋白实施周期性组装和去组装过程。这样，作为小泡SNARE蛋白之一的小突触小泡蛋白与质膜上的SNARE蛋白（突触融合蛋白-1与SNAP-25）在预处理中组装起来成为反式SNARE复合体。在SNARE复合体组装前，突触融合蛋白呈闭锁构象。在此构象条件下，突触融合蛋白的Habc域折叠回来到SNARE基序（motif）中，这种构象排除了SNARE复合体的组装。突触融合蛋白必须“开放”，那样才能发动SNARE复合体的组装。此外，在SNARE复合体组装之前，Munc 18-1是与单体突触融合蛋白缔合在一起的，那时突触融合蛋白处于封闭构象。当Munc 18-1在通过与突触融合蛋白N肽（syntaxin-1 N peptide）的相互作用而结合到正在组装中的反式SNARE复合体时，就改变与突触融合蛋白的结合模式。一旦SNARE复合体已部分组装，复合蛋白的结合会进一步增强SNARE复合体的预处理，这种“超预处理”的SNARE/SM蛋白质复合体于是成为钙触发的膜融合孔底物，这个融合孔被钙与突触结合蛋白的结合所开放。融合孔导致突触结合蛋白和SNARE的相互作用和磷脂的相互作用。然而即使在钙触发以前，突触结合蛋白可能至少也部分地与融合机器相互作用，因为有证据表明，在突触结合蛋白-1敲除的神经元，有去钳制的自发小释放。在融合孔开放以后，已形成的顺式SNARE复合体经过NSF/SNAP ATP酶去组装、小泡再循环，重新填充递质用于再释放。（图引自［11］）

可见，SNARE和SM蛋白的功能原理是简单的（图3-2）。SNARE蛋白埋藏在两个融合膜中形成反式复合体，包含一个从N末端到C末端方向的渐进拉紧四螺旋的SNARE复合体。这个拉紧（扣紧）的反式SNARE复合体迫使融合膜更加靠近，而且使它们的亲水面更不稳定。全长的“顺式”SNARE复合体组装在一起，加上SM蛋白的作用，就使融合孔开放。融合孔的扩大改变了初始的“顺式”SNARE复合体，使之转为“反式”，然后被NSF所解离。NSF通过SNAP接头蛋白与SNARE复合体结合，这样完成了周期［11］。

Ca2+触发融合孔开放有赖于突触结合蛋白。它是一个进化上保守的跨膜蛋白质，有两个结合钙离子的胞质C2结合域。C2结合域开始时被定义为蛋白激酶C的同工酶，是一个功能不清楚的保守序列。对突触结合蛋白-1（Syt1）的研究显示，C2结合域组成了一个可以自律地与钙/磷脂结合的域，此外，C2结合域还组成了一个蛋白质相互作用域。而对于Syt1来讲，它可以结合到突触融合蛋白-1和结合到SNARE复合体［11］。

虽然Syt1开始被克隆时，有人提出它是卡茨长期以来所寻找的钙感知器，其功能是实现快速神经递质释放，但是线虫和果蝇的实验结果出来以后，人们失望了：情况不是这样的。对Syt1基因敲除小鼠的电生理学研究发现，对于前脑神经元，Syt1对快速钙触发的释放是有选择地必需的，而对于融合则并非必需［11］。

Syt1基因敲除的分析，支持“突触结合蛋白钙感知器假说”，但并不排除另外一种可能性，即Syt1的作用是把突触小泡摆放到一定位置，使它靠近电压门控钙通道。现在知道，此功能是由RIM和RIM-BP介导的，而钙结合到Syt1则实现一个不相关的作用。基因敲入小鼠的结果证明，钙结合于Syt1后，触发神经递质的释放。对小鼠的Syt1基因引入内源性点突变，可减少Syt1钙结合亲和力2倍，也减少神经递质释放的钙亲和力2倍。除介导钙触发的释放外，Syt1钳制小释放（mini release）。所以，Syt1结合到SNARE复合体这个过程，是准确度和速度所需要的介导者［11］。

脑内有16个突触结合蛋白，其中8个结合钙，所有的功能研究都是用Syt1做的，但是进一步的分析研究发现，为了突触小泡的同步胞外排，Syt2和Syt9也是钙感知器，而其动力学因不同的突触而有所不同。例如，Syt2是最快的突触结合蛋白，表达于介导声音定位的神经元，这种神经元需要极快的突触反应；而Syt9是最慢的突触结合蛋白，主要表达于边缘系统神经元，在那里介导比较慢的情绪反应［11］。

在融合中，突触结合蛋白并非单独起作用，它需要复合蛋白作为辅因子。复合蛋白是因紧密结合于Syt复合体而被发现的。复合蛋白有缺陷的神经元，显示Syt轻度缺少的表型，它有选择性地减少快速、同步的胞外排，增加自发性的胞外排。复合蛋白的功能有：作为SNARE复合体的预处理因子；作为SNARE复合体的激活者，以便突触结合蛋白以后可以起作用；也可以作为自发释放的钳［11］。

突触结合蛋白也可以作为其他钙依赖融合反应的钙感知器。例如Syt1、Syt7是儿茶酚胺和肽类激素分泌的钙感知器，而Syt2是肥大细胞胞外排的钙感知器。在对嗅神经元的研究中发现，Syt10是胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）胞外排的钙感知器，但是它同Syt1在递质和肽分泌的钙感知器中，功能又是不同的。这样看来，即使在单个神经元中，不同的钙结合蛋白也可以作为不同的钙感知器，服务于不同的钙触发的融合反应。所有钙结合蛋白都调控融合反应，而且似乎都需要复合蛋白作为辅因子。看来是这样的：所有钙触发的胞外排依赖于突触结合蛋白的钙感知器功能以及复合蛋白的功能，不同的突触结合蛋白促成了胞外排通路的特异性［11］。