小泡释放机器的空间组构

近来的研究对于突触前蛋白质分子机器（包括SNARE、SM、RIM等蛋白质复合体），及其与蛋白质复合体密切靠近的钙离子通道之间的关系，有了非常清楚的认识［11］。总的看法是，在突触小泡释放过程中，SNARE复合体起中心作用，该复合体被NSF-SNAP拆卸，在泡裂外排过程中，Munc18-1、Munc13、突触结合蛋白-1和复合蛋白等依次起重要作用［16］。有了这些认识将能更好地解释，何以突触前动作电位到来之后只需几毫秒的时间，突触小泡就可以快速释放其所含递质［11］。

作为对动作电位反应的超快速神经递质释放，只有在一定的条件下才能实现。要把钙通道和经过预处理的突触小泡牵拉在一起和锚定到活动带，需要大的蛋白质复合体，其中心组成部分是3个多域蛋白质——RIM、RIM-BP、Munc13，这三者介导了活动带部位突触小泡的锚定和预处理，而且募集钙通道到锚定和预处理小泡的近处。由此看来，单个大蛋白质复合体组构了释放位点（图3-1）［11］。

1．RIM

RIM是Rab3-interacting molecule（Rab3相互作用分子）的缩写，它结合于小Rab、GTP结合蛋白，定位在突触小泡上，从而锚定小泡；RIM也结合到Munc13从而激活它。Munc13是一个预处理因子，它催化突触融合蛋白构象的开与关，把它从闭锁状态转变成开放状态，促进SNARE复合体的组装［11］。

2．钙通道

钙通道必须定位于锚定的以及预处理的小泡附近，以便能够快速地耦合于动作电位的到来，达到钙离子触发的胞外排。钙通道一般定位于离开锚定小泡不到100 nm的距离处。RIM及与RIM相互作用的分子RIM-BP除互相结合以外，两者都结合到钙通道。基因敲除小鼠的RIM以及基因敲除果蝇的RIM-BP，都导致突触前活动带丢失钙通道并减少钙内流。所有这些资料显示，RIM和RIM-BP联合起来发挥作用，用以募集钙通道到达释放位点。因此，这是一个极度节省的设计方案，用含有RIM的单个蛋白质复合体作为中心成分，介导所有的关键蛋白质，使之共同定位到活动带来。这个蛋白质复合体定位了突触小泡，定位了钙通道以及接近释放位点的小泡预处理因子，从而使得动作电位快速地耦合到递质释放（图3-1）［11］。

如前所述，我们现在已经可以粗略地解释一下释放机制、它的速度以及它如何调节神经递质的释放。但是，释放机制好比是一栋还没完全建好的房子，还没有管道装置，也没有窗户，因此还可以有大的、新的问题产生。下面将简要讨论这些问题，例如融合问题、钙触发问题等。虽然关于活动带已有很多有趣的进展，不过限于篇幅，这里只能谈其中的一些新问题，以及由此产生的新看法［11］。

为了达到快速的钙触发释放，突触小泡融合机器必须处于一种能量上不太稳定的状态（图3-3a）。钙结合于突触结合蛋白，于是促进融合孔开放，突触小泡融合机器被预处理而处于一种激励的亚稳定状态。但是，对这种预处理的性质和机制如何还存在争论［11］。

图3-3　融合的能量景观图（a）以及建议的SM蛋白（Munc18）在促进融合孔开放中的作用图（b）

（a）图解式表示小泡的能量水平，此小泡是锚定的、经预处理的和融合的。图显示，在预处理的时候有部分SNARE复合体组装。据提示这可以提供融合所必需的多数能量。这样，钙触发仅增加少量能量就可引起融合孔开放。（b）Munc18在融合中的功能模式图。在预处理入坞小泡之前，Munc18结合到封闭形式的突触融合蛋白-1（synt1），这个相互作用基本上是调节性的，用来维持进入到融合反应的一定进入速率，也额外作用于Munc18和突触融合蛋白-1的相互稳定。在预处理条件下，部分SNARE复合体得以组装（中间），这与非常明显的构象变化关联着。突触融合蛋白-1的构象变化使其自身必定打开；Munc18的构象变化导致其自身的结合改变，从与一个封闭的突触融合蛋白-1的构象结合，转变到与一个开放的突触融合蛋白-1的构象结合，这是通过突触融合蛋白-1的N肽实现的。全长的SNARE复合体的组装（右）产生融合孔开放。在整个融合反应过程中，Munc18被推想是跨骑在组装的SNARE复合体上，而且它耦合于膜的靠拢过程，这是由SNARE复合体的能量释放引起的，可能由于介导了磷脂混合。（图引自［11］）

很可能在钙触发小泡外排之前，已经有部分SNARE复合体被组装。在神经元、嗜铬细胞以及脂质体上已有漂亮的研究显示，仅由1～3个SNARE复合体所释放的能量就足以驱动融合。然而细致的定量研究发现，SNARE蛋白很多，大约每个小泡有70个小突触小泡蛋白分子。这表明，生理性的融合是由多个SNARE复合体组装所完成的［11］。

“预处理假设”的一个可能模式是这样的：SNARE复合体先部分组装，从而能够提高突触小泡的能量水平和使之达到前融合状态（图3-3）。此模型受到相当可靠的证据支持，但还不是已被证明了的。复合蛋白仅结合于部分或全部组装的SNARE复合体，但复合蛋白结合于SNARE复合体对预处理以及激活突触小泡融合都是必需的。因此在融合发生前，至少部分组装的SNARE复合体一定要存在，这种预处理可以让复合蛋白结合上去。Munc13把突触融合蛋白从闭锁构象转变为开放的，这是对突触小泡有选择性地进行预处理所需要的。这个转变在融合的上游，也就是钙触发的上游。这再一次提示，在融合之前SNARE复合体至少已部分地被组装起来了。此外，由开放的突触融合蛋白和SNAP-25所组成的t-SNARE(3)复合体，可以在原始状态的轴浆膜上观察到。它在钙触发的神经递质释放以前就存在了。最后一点，钙可以触发突触小泡的融合，时间短于100 μs。如此短的时间不足以满足突触融合蛋白开放所需的长度，不足以形成SNARE复合体，也不足以满足突触结合蛋白通过钙离子触发的融合［11］。

上面所提几方面的证据提示，在预处理过程中有部分的SNARE复合体组装。可以这样设想，钙结合到突触结合蛋白而且形成SNARE复合体，将产生不确定的中间状态。但是，钙触发上游的预处理还需要复合蛋白和Munc13的功能，这还难以用已知的模型来解释［11］。

完整的SNARE复合体如何准确地组装起来，诱导融合孔的开放？这一点还是不清楚的。对SM蛋白的作用也同样不清楚。虽然只需要少数的SNARE复合体就可以产生融合，但是看来生理性的突触小泡融合可能要几十个SNARE复合体。对于每个小泡来讲，SNARE复合体会有一个效应，即数目的多少影响融合的速度以及钙依赖的递质释放，因为从突触融合蛋白的作用在于组装SNARE复合体这点，并根据质量作用定理，就可以预测，此作用依赖于底物浓度。所以，对这样一个问题进行研究将是有意思的，即改变SNARE的数目，考察它对于释放性质有何影响［11］。

SNARE复合体的组装如何作用于膜？SNARE蛋白的主要作用是把膜拉拢在一起，还是SNARE复合体的组装产生了一种力量，被转移到SNARE的跨膜区，从而跨膜区得以介导脂质的融合，及/或融合孔的形成？从生理上看，在小突触小泡蛋白内增加SNARE基序和跨膜区的距离，可以影响神经递质的释放；同样，只要给突触融合蛋白上连接跨膜区与SNARE的基序增加3个残基，就可严重影响钙触发的融合。可见，由SNARE复合体产生的力传送到膜，这对于融合是必需的［11］。

总的看来这些资料提示，SNARE的跨膜区不仅直接形成融合孔，也是膜的锚定物。这些资料使我们对SNARE是怎么工作的看法反而简单了，即把SNARE的活性还原到相对于膜平面产生力的物体，SNARE的作用是在垂直方向上把两个膜拉拢，而不是在水平方向［11］。

如前所述，钙感知器-突触结合蛋白以及它的助手复合蛋白，它们两者把突触前的钙信号转导成小泡释放信号。这些蛋白质可能作用在一个预处理过的融合分子机器上，而此机器正准备要付诸行动。但是，对这两个关键演员的准确相互作用还不完全清楚［11］。

前面讨论的都是同步化释放，除此以外，神经递质还有另外两种释放方式——非同步化释放和自发性释放。虽然现在已经对同步化释放有了深入认识，但对另外两种释放仍然知之甚少。非同步化释放在动作电位到来后的数十毫秒或数十秒发生，自发性释放则在没有动作电位的条件下发生。上述3种释放有一点是相同的：它们都需要小泡的融合过程，即都需要SNARE复合体；但是在为了触发所需Ca2+的来源、对Ca2+的需要程度以及钙感知器（sensor）的实体方面有所不同。例如，非同步化释放和同步化释放都严格地需要Ca2+，但部分自发性释放可能不需要Ca2+；又如，同步化释放需要突触结合蛋白1、2和9作为Ca2+感知器，但对非同步化释放所需的Ca2+感知器是什么仍不清楚［17］。

就脊椎动物的Syt1、Syt2、Syt9基因敲除神经元以及果蝇的Syt1基因敲除神经元而言，虽然两种敲除都阻断了同步化的递质释放，但并不是所有钙依赖的释放都被去掉了。在多数突触上，不论它们是离体的还是活体的，当动作电位的爆发波到来时，剩余的钙刺激所引起的释放被戏剧性地易化了。这个剩余的释放常被称为异步化释放，因为它落在同步化释放的后面，并不紧密耦合于动作电位［11］。